孫紅梅

摘要：目的：采用大鼠8周遞增負荷游泳訓練模型，探討不同負荷運動對大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)的影響，以及引起心肌、血清中NO、NOS變化的原因。方法：純種健康雄性SD大鼠36只，按體重隨機分為對照組、適宜負荷組、過度負荷組，觀察8周游泳訓練后大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)及心肌、血清中NO、NOS的變化。結(jié)論：1) 不同負荷的游泳訓練可以提高大鼠心肌、血清中NO的含量；2) 適宜負荷的游泳訓練可以提高大鼠心肌、血清中cNOS活性，改善大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)，提高心血管系統(tǒng)的功能，推測適宜負荷的游泳訓練提高大鼠心肌、血清中cNOS的活性可能有利于大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)的改善；3) 長時間過度負荷的游泳訓練可以使大鼠心肌、血清中iNOS活性升高，大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)損傷，使心血管系統(tǒng)功能下降，推測過度負荷的游泳訓練引起的大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)損傷可能與大鼠心肌、血清中iNOS活性的升高有關。

關鍵詞：遞增負荷；鼠；一氧化氮；一氧化氮合酶；心肌超微結(jié)構(gòu)

中圖分類號：G804.2文獻標識碼：a文章編號：1007-3612(2008)07-0936-03

目前有關運動對一氧化氮（NO）及一氧化氮合酶（NOS）的影響已有部分研究成果，但關于不同運動負荷對心肌超微結(jié)構(gòu)、心肌和血清中NO、NOS影響的研究尚未見系統(tǒng)報道。本文采用大鼠8周遞增負荷游泳訓練模型，觀察不同運動負荷時大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)和心肌、血清中NO、NOS的變化，探討不同負荷運動對大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)的作用，以及引起大鼠心肌、血清中NO、NOS變化的原因，從而為探討心臟對運動訓練發(fā)生適應性變化的機制提供實驗依據(jù)。

1研究對象與方法

1.1研究對象

純種健康雄性SD大鼠36只，按體重隨機分為對照組（n=12）、適宜負荷組（n=12）、過度負荷組(n=12)。分籠飼養(yǎng)，每籠6只。飼養(yǎng)溫度21～24℃，濕度44％～55％，國家標準嚙齒類動物飼料喂養(yǎng)，自由飲水進食，并記錄每天飲食情況。

1.2研究方法

1.2.1運動條件游泳池100 cm×60 cm×70 cm，水深超過大鼠身長的2倍，水溫31～32℃。

1.2.2運動方案參照北京醫(yī)科大學運動醫(yī)學研究所朱全等建立的大鼠過度訓練模型［1］，本實驗建立了大鼠遞增負荷游泳訓練模型：1） 對照組：平時不運動，飼養(yǎng)條件與運動訓練組相同。大鼠開始正式訓練前，每天先適應性游15 min，3 d后開始正式訓練。2） 適宜負荷組：正式訓練時，每周訓練5 d，每天1次。第一次游20 min，以后逐日增加游泳時間。第一周末時每次游半小時，第二周末時每次游1 h，第三周末時每次游2 h。從第四周開始強度不再增加，保持到實驗結(jié)束。

3） 過度負荷組：前三周過度負荷組和適宜負荷組訓練完全相同，第四周起開始高強度訓練。第四周開始時在過度負荷組大鼠尾部負0.5％體重的重物，每天游2 h。第四周末時負重增加至體重的1％，第五周末時增加至體重的1.5％，第六周末時增加至體重的2％，從第七周開始增加訓練次數(shù)，每天上午訓練一次，負2％～3％體重游2 h，下午訓練一次，負3％～6%體重游1～1.5 h，直至訓練結(jié)束。如有力竭表現(xiàn)（力竭標準為沒入水中10 s不能浮出水面），撈出水面休息5 min后繼續(xù)訓練至完成訓練任務。訓練時間共8周。

1.3取材大鼠末次游泳訓練后24 h，稱重，斷頭處死，取血，分離血清備用。迅速解剖大鼠，取左心室，在冰生理鹽水中浸泡，洗取殘血，濾紙吸干水分，部分心肌組織用生理鹽水制成10％勻漿，低溫離心，取上清液備用；部分心肌組織用于制備電鏡照片。

1.4指標測試NO、NOS測定：NO采用硝酸還原酶法，NOS采用比色法，勻漿上清液蛋白質(zhì)采用考馬斯亮蘭法，試劑盒購于南京建成生物工程研究所，所有測定均按試劑說明進行。

心肌電鏡照片：由湖南醫(yī)科大學電鏡實驗室拍攝。

1.5結(jié)果處理全部數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差（X±SD）表示。數(shù)理統(tǒng)計采用國際通用統(tǒng)計軟件SPSS11.0 for Windows的t檢驗，顯著性水平取P<0.05和P<0.01。

2結(jié)果

2.1不同負荷游泳訓練后大鼠一般情況的變化

8周游泳訓練后，對照組和適宜負荷組大鼠神態(tài)安靜，皮毛光潔整齊，眼睛有神。適宜負荷組大鼠在訓練后期能順利完成訓練任務。過度負荷組大鼠神態(tài)倦怠，眼神黯淡無光，毛發(fā)稀疏，易受驚嚇，進食量明顯減少，反應能力和運動能力降低，有的已經(jīng)明顯無法承受運動負荷，必須經(jīng)過幾次休息才能完成整個訓練。

2.2不同負荷游泳訓練對大鼠NO、NOS的影響

2.2.1不同負荷游泳訓練對大鼠血清NO、NOS的影響8周游泳訓練后，血清中NO含量，適宜負荷組、過度負荷組較對照組均有極顯著性增加（P<0.01），且適宜負荷組較過度負荷組有顯著性增加（P<0.05）；結(jié)構(gòu)型一氧化氮合酶（cNOS）活性，適宜負荷組極顯著高于對照組（P<0.01），過度負荷組稍高于對照組但無顯著性差異，適宜負荷組極顯著高于過度負荷組（P<0.01）；誘導型一氧化氮合酶（iNOS）活性，過度負荷組極顯著高于對照組（P<0.01），適宜負荷組比對照組稍高但無顯著性差異，過度負荷組極顯著高于適宜負荷組（P<0.01）(表1)。

2.2.2不同負荷游泳訓練對大鼠心肌NO、NOS的影響8周游泳訓練后，心肌中NO含量，適宜負荷組較對照組有極顯著性增加（P<0．01），過度負荷組較對照組稍有增加但無顯著性差異，而適宜負荷組較過度負荷組有顯著性增加（P<0．05）；cNOS活性，適宜負荷組極顯著高于對照組、過度負荷組（P<0.01），過度負荷組比對照組稍低但無顯著性差異；iNOS活性，過度負荷組極顯著高于對照組、適宜負荷組（P<0．01），適宜負荷組比對照組稍低但無顯著性差異(表2)。

2.3不同負荷游泳訓練對大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)的影響

經(jīng)過8周游泳訓練，不同運動負荷使大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)發(fā)生不同變化：對照組心肌組織結(jié)構(gòu)正常，肌絲排列整齊，線粒體數(shù)較多，呈帶狀排列，嵴排列整齊，線粒體膜完整，閏盤清晰，偶有擴張；與對照組相比，適宜負荷組心肌組織中肌絲排列整齊，數(shù)量增加，明暗帶相間，結(jié)構(gòu)清晰，線粒體數(shù)明顯增多，嵴排列整齊規(guī)則且密集，線粒體膜完整，閏盤整齊，呈臺階狀；與對照組相比，過度負荷組心肌組織結(jié)構(gòu)不完整，肌絲粗細不均，部分肌絲呈節(jié)段性變形，線粒體腫脹，空泡變形，嵴排列不整齊，線粒體膜被損，閏盤出現(xiàn)明顯擴張，部分閏盤不成形。

3分析與討論

3.1不同負荷游泳訓練對大鼠心肌、血清中NO水平的影響本研究的結(jié)果表明適宜負荷的游泳訓練可以提高大鼠心肌、血清中NO的水平。研究證實，搏動性血流和血管剪切應力是調(diào)節(jié)NO釋放的兩個決定性因素［2］。大鼠經(jīng)過8周遞增負荷游泳訓練后，尤其是適宜負荷組，心血管系統(tǒng)發(fā)生適應性變化，改變血流對心血管內(nèi)皮細胞的機械作用，導致內(nèi)皮細胞的剪切應力改變，血管剪切應力改變使細胞膜上的Ca2+依賴型K+通道開放，導致細胞內(nèi)Ca2+增多，Ca2+通過鈣調(diào)素(CaM)激活NOS，調(diào)節(jié)NO的合成［3］，使NO分泌增加。

NO的藥理學研究表明［4］，去甲腎上腺素(NE)、乙酰膽堿(Ach)、緩激肽(BK)與位于內(nèi)皮細胞膜上的α2－腎上腺素能受體、膽堿能受體、緩激肽受體結(jié)合可誘導NO釋放。大鼠經(jīng)過8周遞增負荷游泳訓練后血液中NE、Ach、BK生成增加，與相應受體結(jié)合，促進內(nèi)皮細胞NO釋放。此外，白細胞介素－1、干擾素－γ、腫瘤壞死因子等炎性細胞因子釋放可促進血管和心肌細胞中iNOS基因的轉(zhuǎn)錄和表達，從而促進NO的大量合成和釋放。大鼠經(jīng)過8周遞增負荷的游泳訓練，尤其是過度訓練后，血液中細胞因子大量生成，通過促進血管和心肌細胞中iNOS基因的轉(zhuǎn)錄和表達進而促進NO的生成。然而，單純從NO生成的機械刺激和化學刺激兩方面尚難完全解釋運動使NO生成增加。NO的合成除了受剪切應力、機體代謝產(chǎn)物的影響外，還受血漿中NO前體－L-Arg的含量和 L-Arg跨膜轉(zhuǎn)運能力以及NO清除率的影響。大鼠8周遞增負荷游泳訓練后，心血管系統(tǒng)L-Arg的跨膜轉(zhuǎn)運能力增強，使合成NO的前體L-Arg數(shù)量增多，從而使NO合成增加。

由此可見，搏動性血流和血管剪切應力增強、血液NE、Ach、BK生成增加、炎性細胞因子增多及心血管系統(tǒng)L-Arg跨膜轉(zhuǎn)運能力增強都可使NO合成增加。

3.2不同負荷游泳訓練對大鼠心肌、血清中NOS活性的影響

3.2.1不同負荷游泳訓練對大鼠心肌、血清中cNOS活性的影響本實驗結(jié)果表明適宜負荷的游泳訓練可以使大鼠心肌、血清中cNOS活性升高。有研究表明［3］，cNOS活性需Ca2+/CaM存在，受Ca2+濃度調(diào)節(jié)，當Ca2+/CaM復合物與cNOS結(jié)合時，導致此酶激活。任何能引起Ca2+進入細胞內(nèi)的因素均能導致cNOS活性的增加。如Ach、BK以及剪切應力等刺激均可使Ca2+進入細胞增加，cNOS活性升高，導致內(nèi)皮細胞NO合成增加。此外，有研究表明［4］，血流流動產(chǎn)生的剪切應力可以調(diào)控cNOSmRNA的表達。大鼠經(jīng)過8周遞增負荷的游泳訓練，心血管系統(tǒng)的血流動力學發(fā)生改變，剪切應力加大，使cNOSmRNA表達上調(diào)。由此可見，機體運動時血流速度加快，剪切應力加大，以及細胞內(nèi)Ca2+濃度升高，可能是導致大鼠心肌、血清中cNOS活性升高的原因。

3.2.2不同負荷游泳訓練對大鼠心肌、血清中iNOS活性的影響本研究發(fā)現(xiàn)，長時間過度負荷的游泳訓練可以使大鼠心肌、血清中iNOS活性升高。大鼠經(jīng)過8周遞增負荷的過度訓練，機體不斷處于缺氧狀態(tài)。缺氧使內(nèi)皮損傷，功能下降，可能是心肌、血清中iNOS活性升高的機制之一。此外，白細胞介素－1、干擾素－γ、腫瘤壞死因子等炎性細胞因子可以通過對iNOS基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯及翻譯后的調(diào)控等方面的調(diào)控來調(diào)節(jié)iNOS的生成。長時間大負荷運動后，血液中白細胞介素－1、干擾素－γ、腫瘤壞死因子等炎性細胞因子大量合成和釋放，這些細胞因子可以促進心肌、血清中iNOS基因的轉(zhuǎn)錄和表達［5］。由此可見，運動后炎性細胞因子水平提高可能也是大鼠心肌、血清iNOS活性升高的機制之一。

3.3不同負荷游泳訓練對大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)的影響大量實驗證明［6-8］，適宜的運動負荷可使心肌細胞發(fā)生適應性生理變化，而過度負荷及過度訓練可導致心肌缺血、缺氧，損傷心肌超微結(jié)構(gòu)，影響心肌的正常功能。本實驗結(jié)果與已有報道的研究結(jié)果基本一致。適宜負荷組的運動是耐力性運動，屬中低強度有氧訓練，運動中機體供能、需能基本平衡，內(nèi)環(huán)境基本保持穩(wěn)定，運動中能夠維持心臟的正常供能、供血、供氧；同時耐力訓練的負荷又給大鼠心血管系統(tǒng)以一定刺激（化學的和機械性牽拉的），正是這種刺激導致了心肌結(jié)構(gòu)的適應性變化，并為心臟機能的改善提供結(jié)構(gòu)性基礎。過度負荷組的運動是長時間的疲勞運動，在休息期內(nèi)不允許機體有充分的恢復便進入第二次運動，使機體的內(nèi)環(huán)境破壞增強，無法維持心臟的正常供能、供血、供氧，最終導致心肌細胞的損傷；同時血流動力學的改變也是過度訓練中的一個很明顯的特點，即過度訓練中發(fā)生的劇烈的心血管系統(tǒng)反應使心肌受到過分的牽拉而導致心肌細胞損傷。耐力訓練中心肌受到的牽拉是耐力訓練使心臟發(fā)生適應性變化的原因，但過度訓練中，在內(nèi)環(huán)境嚴重破壞的情況下這種牽拉可能成為損傷性的［6］。

3.4大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)的變化與NO、NOS的變化存在的可能關系研究證實［9］，激活cNOS合成皮摩爾或飛摩爾水平的NO，激活iNOS合成納摩爾水平的NO，較cNOS合成的NO濃度約高1000倍。NO作為一種自由基，是一把“雙刃劍"，在低濃度調(diào)節(jié)生理功能，在高濃度則誘導和加重組織細胞損傷［3］。iNOS活性升高后，NO過量合成，NO的過量合成可造成低血壓性休克，細胞損傷，直至細胞核酸的亞硝?；?、脫氨基、氧化、破壞DNA結(jié)構(gòu)等多種病理損傷。同時隨著NO的大量合成，底物L-Arg大量消耗，iNOS催化生成超氧陰離子，超氧陰離子進一步與NOS作用生成過氧化亞硝酸離子，而過氧化亞硝酸離子為強氧化劑，與H+生成HNO3， HNO3在pH為7時代謝出許多毒性產(chǎn)物，進一步造成細胞膜、蛋白質(zhì)、酶類、核酸的損傷。本實驗結(jié)果顯示，經(jīng)過8周遞增負荷游泳訓練，適宜負荷組大鼠心肌、血清中 cNOS與對照組相比活性升高（P<0.01），同時大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)產(chǎn)生適應性變化，使心血管系統(tǒng)功能增強；而過度負荷組大鼠心肌、血清中iNOS與對照組相比活性升高（P<0.01），同時伴有心肌超微結(jié)構(gòu)的損傷，導致心血管系統(tǒng)功能下降。由此推測，運動訓練引起大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)的改變可能與不同負荷運動使NOS活性發(fā)生不同的變化有關。適宜負荷的游泳訓練使大鼠心肌、血清中cNOS活性升高，激活皮摩爾或飛摩爾水平的NO，可能對大鼠心肌細胞產(chǎn)生良性影響，使大鼠心血管系統(tǒng)功能增強；而長期的過度負荷使大鼠心肌、血清中iNOS活性升高，產(chǎn)生納摩爾水平的NO，導致細胞毒作用產(chǎn)生，可能對大鼠心肌細胞產(chǎn)生負面影響，損傷大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)，使大鼠心血管系統(tǒng)功能下降。但是NO、NOS是通過何種機制來影響大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)的還需作進一步深入研究［10-12］。

4結(jié)論

1) 不同負荷的游泳訓練可以提高大鼠心肌、血清中NO的含量。

2) 適宜負荷的游泳訓練可以提高大鼠心肌、血清中cNOS活性，改善大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)，提高心血管系統(tǒng)的功能，推測適宜負荷的游泳訓練提高大鼠心肌、血清中cNOS的活性可能有利于大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)的改善。

3) 長時間過度負荷的游泳訓練可以使大鼠心肌、血清中iNOS活性升高，大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)損傷，使心血管系統(tǒng)功能下降，推測過度負荷的游泳訓練引起的大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)損傷可能與大鼠心肌、血清中iNOS活性的升高有關。

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