張　童

摘要：闡述了幾種禾本科植物離體再生體系研究現(xiàn)狀。著重介紹了外植體選擇、褐化現(xiàn)象及其防治措施以及離體再生體系建立的主要步驟，最后對離體再生培養(yǎng)技術(shù)做了展望。

關(guān)鍵詞：外植體；離體再生；愈傷組織；褐化現(xiàn)象

0 前言。在20世紀60年代和70年代，隨著植物細胞和組織培養(yǎng)方法的增多，人們已開始將其應(yīng)用于研究許多重要的作物。在早期的工作中，由于使用相對成熟而復雜的外植體，因此限制了植株的形態(tài)發(fā)生和表達。組織培養(yǎng)植株再生中器官發(fā)生包括由莖尖、腋芽、原球莖、球莖、塊萃、鱗莖等外植體直接分化成器官的直接發(fā)生和外植體先脫分化形成愈傷組織再分化成器官的間接器官發(fā)生，筆者主要是做前者。白茅為禾本科白茅屬多年生草本，根可吃，也可入藥，根狀莖十分發(fā)達，在生長地塊上縱橫交錯，可防風固堤，能在其它植物難以生長的純沙地上生長。白茅根的化學成分以三萜類化合物為主：蘆竹素(Amndoin)、白茅素(Cylindrin)、羊齒烯(Ferrleno1)、喬木萜烷(Arborane)、異喬木萜烷(Isoarborino1)、西米杜鵑醇(Simiareno1)、喬木萜醇(Arborino1)、喬木萜醇甲醚(Arborinol methyl ether)、喬木萜酮(Arborinone)和木栓酮(Filedelin)等。其莖含有果糖、甘露醇、檸檬酸等成分。白茅根實際為白茅的根狀莖。其性寒、味甘，能清熱涼血、利尿通淋，關(guān)于白茅根的降溫作用早在清代已有記載。如張錫鈍在《醫(yī)學衷中參西錄》中這樣說"茅根稟少陽最初之氣，涼而能散。其涼散之力，能將臟腑經(jīng)絡(luò)間之毒熱盡數(shù)排出" 且把單味鮮白茅根列為治療溫熱病的重要方劑[1]。近年來，在白茅根的化學成分、藥理作用、臨床應(yīng)用與炮制等研究方面已取得了一定進展，但還存在一些問題，目前對其藥理作用研究還停留在表面，在炮制工藝方面缺乏行之有效的標準規(guī)范化操作方法，今后需利用現(xiàn)代科學技術(shù)與方法對白茅根化學成分進行系統(tǒng)研究探索。其主要化學成分與生理活性的關(guān)系，同時進一步完善白茅根質(zhì)量標準研究內(nèi)容，建立一種國內(nèi)外均可接受的完整的質(zhì)量控制系，為其走向國際市場

奠定堅實的技術(shù)基礎(chǔ)利用植物脫毒、離體快繁、人工種子等技術(shù)可以解決一些植物種質(zhì)退化、珍稀名貴植物快速繁殖等問題。隨著人們對離體條件下誘導植物外植體再生植株的機理及影響因素、外植體褐變及其抑制等研究的不斷深入，植株再生體系的建立已經(jīng)取得了快速發(fā)展。

1 外植體選擇

對于離體再生體系的建立，選擇合適的外植體尤為重要。植物細胞具有全能性, 任何組織、細胞、器官都能再生植株, 但事實上, 不同品種、器官之間分化能力差異很大, 外植體的制備和培養(yǎng)又是建立在無菌操作基礎(chǔ)上的一門技術(shù), 選擇適宜的外植體是確保外植體培養(yǎng)成功的一個重要因素, 把好材料的滅菌關(guān)是提高接種成功率的關(guān)鍵。對于不同的實驗目的選擇外植體的方法也不一樣，下面介紹幾種禾本科外植體的不同選擇方法及要求。

據(jù)了解，在小麥遺傳轉(zhuǎn)化中,幼胚是應(yīng)用最早的外植體。許多研究認為,幼胚愈傷組織的誘導和植株再生能力高于幼穗和成熟胚,目前獲得成功轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植株大多數(shù)來自于幼胚或幼胚愈傷組織。然而,陳梁鴻等,林剛、李根英、趙林姝等在比較幼穗和幼胚為受體的轉(zhuǎn)化研究后認為,幼穗的轉(zhuǎn)化效果優(yōu)于幼胚,幼穗較幼胚更耐繼代,更易形成再生植株。而對于麻竹的離體快速繁殖而言，選取枝條剛停止生長，枝稍展葉3～7片，基部枝箕枯黃或者開始剝落，末萌側(cè)芽或剛萌側(cè)芽作為外植體為佳。在水稻不同外植體的組織培養(yǎng)研究中，研究最多的為花藥、幼穗、幼胚、成熟胚(種子)4種外植體。玉米的外植體最常選用幼胚、幼葉、幼雌（雄）穗、下胚軸和成熟胚。白茅主要是莖生長點和根狀莖的節(jié)，最好的外植體材料是地上部與地下部交接處，因為此處芽點最多，利于誘導出更多叢生芽。

植物組織培養(yǎng)要能在各個方面得到有效的應(yīng)用，首先取決于實驗材料培養(yǎng)效果的優(yōu)劣，而影響培養(yǎng)效果的主要因素是基因型和外植體種類。

2 離體再生系統(tǒng)的建立

廣義的植物組織培養(yǎng)不僅包括在無菌條件下利用人工培養(yǎng)基對植物組織的培養(yǎng)，而且包括對原生質(zhì)體、懸浮細胞和植物器官的培養(yǎng)。因為培養(yǎng)的器官已經(jīng)脫離了母體，所以也稱之為離體培養(yǎng)。植物組織培養(yǎng)研究自德國植物生理學G．Haberlandt的工作開始，及1934年美國學者White等用番茄根進行組織培養(yǎng)，首次建立了活躍生長的無性繁殖系以來，至今已有100多年的歷史?，F(xiàn)在植物組織培養(yǎng)技術(shù)已在科研和生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用，成為最常用的生物工程技術(shù)之一。植物組織培養(yǎng)可以進行植物離體快繁、無病毒苗木培育、培育新品種或創(chuàng)制新物種、次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)、植物種質(zhì)資源的離體保存、人工種子等方面的應(yīng)用。其中離體快繁是組織培養(yǎng)在林木生產(chǎn)上應(yīng)用最廣泛、最成功的一個領(lǐng)域。離體再生體系建立關(guān)鍵是外植體的選擇、培養(yǎng)基和無菌體系的建立，前文筆者已將外植體的選擇做了介紹，這里不再贅述，不同植物所需要的生長條件不同,所用的培養(yǎng)基也有所不同。較常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基有MT、MS、SH、N6 、White 等。

無菌體系的建立主要有外植體的脫毒、所需培養(yǎng)基和操作工具的高壓滅菌、 超凈工作臺。外植體脫毒通常是通過莖尖處理、莖尖結(jié)合熱處理、冷處理、化學藥劑處理及愈傷組織處理等方法可以去除植物病毒[2]。培養(yǎng)基用常壓或高壓蒸煮等濕熱滅菌、器械采用灼燒滅菌、玻璃器皿及耐熱用具采用干熱滅菌、不耐熱的物質(zhì)采用過濾滅菌、植物材料表面用消毒劑滅菌、物體表面用藥劑噴霧滅菌、接種室等空間采用紫外線或熏蒸滅菌。

3 影響愈傷組織形成的激素

植物組織培養(yǎng)是在無菌條件下,將離體的植物器官(根尖、莖尖等)、組織(形成層、花藥組織等)、細胞(體細胞、生殖細胞等)、胚胎(成熟或未成熟的胚)、原生質(zhì)體等在人工配制的培養(yǎng)基上培養(yǎng),給予適宜的培養(yǎng)條件,誘發(fā)其產(chǎn)生愈傷組織或潛伏芽或長成完整的植株的技術(shù)[3]，其原理是細胞全能性。在組織培養(yǎng)中,愈傷組織和胚狀體能否形成是培育出新植株的關(guān)鍵。通過在基礎(chǔ)培養(yǎng)基里添加一定濃度的外源激素,可誘導出愈傷組織、胚狀體、不定芽、根等器官,最終獲得再生植株或次生物質(zhì)。最常用的誘導愈傷組織的生長素是IAA、NAA和2 ,4 - D ,所需濃度為0. 01～10 mg/ L 。最常用的細胞分裂素是KT和ABA ,使用濃度為0. 1～10mg/ L 。KT的主要作用是促進細胞分裂和愈傷組織分化。ABA對植物體細胞胚的發(fā)生與發(fā)育具有重要作用。各類植物激素的生理作用雖有相對專一性,但是植物的各種生理效應(yīng)是不同種類激素之間相互作用的綜合表現(xiàn)。

4 植物組織培養(yǎng)中的褐化現(xiàn)象及其防止措施

4.1 褐化現(xiàn)象的原因及其特性

褐化是植物組織培養(yǎng)中較為常見的一種現(xiàn)象，也稱為褐變，在植物組織培養(yǎng)、細胞懸浮培養(yǎng)和原生質(zhì)體培養(yǎng)中常有發(fā)生。褐變現(xiàn)象原因主要有非酶促褐變和酶促褐變。非酶促褐變是由于細胞受脅迫或其他不利條件影響所造成的細胞程序化死亡或自然發(fā)生的細胞死亡，即壞死形成的褐變現(xiàn)象，并不涉及酚類物質(zhì)的產(chǎn)生。在外植體再生分化過程中會有很多因素造成的細胞程序化死亡或自然發(fā)生的細胞死亡，但這種褐變?nèi)舨扇∵m當措施或者愈傷組織適應(yīng)了脅迫環(huán)境就不再發(fā)生。多數(shù)認為，植物組織培養(yǎng)中的褐化現(xiàn)象主要是由酶促褐變引起的，即由多酚氧化酶(PPO，Poly-phenol Oxidase)作用于天然底物酚類物質(zhì)而引起的。一般認為，褐化是指外植體或培養(yǎng)材料接種后在組織培養(yǎng)過程中，由于切割造成機械損傷，傷口處分泌出酚類化合物，在有氧條件下，切面細胞中的酚類物質(zhì)為多酚氧化酶催化，氧化為醌，醌再通過非酶促反應(yīng)產(chǎn)生有色物質(zhì)而導致組織褐變，變成棕褐色或暗褐色，并逐漸擴散到培養(yǎng)基中，抑制細胞內(nèi)其它酶的活性，影響細胞的正常代謝，毒害整個組織，導致組織死亡。

4.2 褐化現(xiàn)象的防治措施

褐化現(xiàn)象的防治措施主要是根據(jù)導致褐化的原因來解決。最直接的防治措施就是在培養(yǎng)基中添加防褐劑，選用適宜的抗氧化劑與吸收劑種類及含量。其它防治措施還有改變培養(yǎng)基的狀態(tài)、選擇適宜的接種方式、通過試驗選擇適宜的消毒方式等。

5 小結(jié)

21世紀是生物技術(shù)迅速發(fā)展的世紀，而植物組織培養(yǎng)技術(shù)是生物技術(shù)中的重要內(nèi)容，可以用于植物育種、脫毒和離體快繁、種質(zhì)資源的保存及其交換，在遺傳、生化、生理、病理等研究上均有應(yīng)用。組織培養(yǎng)是生物工程的基礎(chǔ)和關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，并且在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實際應(yīng)用中越來越廣泛，發(fā)揮的作用越來越大。據(jù)了解，現(xiàn)在市場對組培苗的需求量逐步遞增，這為植物組織培養(yǎng)離體快繁技術(shù)提供了廣闊的前景。當然，現(xiàn)在的離體再生培養(yǎng)技術(shù)與理論還有待更好的完善，如污染、褐化現(xiàn)象等問題的有效防治措施，隨著科技的進步，這項技術(shù)會發(fā)揮巨大的作用。

參考文獻

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