王學(xué)貴 伍智華 沈麗淘 田永清

（1.農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)試驗(yàn)室，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣州，510642；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院）

WANG Xuegui1,2,WU Zhihua2,SHEN Litao1,TIAN Yongqing1

42種藥用植物甲醇提取物對(duì)番茄灰霉病菌抑菌活性的研究

王學(xué)貴1，2伍智華2沈麗淘2田永清1

（1.農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)試驗(yàn)室，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣州，510642；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院）

運(yùn)用菌絲生長速率抑制法測定了42種植物甲醇提取物對(duì)番茄灰霉病的抑菌活性。試驗(yàn)結(jié)果表明，心籽絞股藍(lán)、海南五針?biāo)?、水馬桑3種植物提取物對(duì)番茄灰霉病菌的抑菌作用較好，在5 mg/mL濃度下抑制率分別為83.68%，76.21%，60.88%；并進(jìn)一步測定心籽絞股藍(lán)、海南五針?biāo)杉八R桑對(duì)番茄灰霉病的毒力，其分別為1.000 mg/mL，3.275 mg/mL及5.050 mg/mL。心籽絞股藍(lán)表現(xiàn)出對(duì)番茄灰霉病菌有較好的抑制作用，但其抑菌活性成分還需進(jìn)一步深入研究。

番茄灰霉病 植物甲醇提取物 心籽絞股藍(lán) 抑菌活性

番茄是世界上最主要的蔬菜作物之一，由于含有豐富的營養(yǎng)成分，在人們?nèi)粘Ｉ钪姓加信e足輕重的地位。番茄灰霉病是番茄生產(chǎn)過程中的主要病害之一，常造成果實(shí)腐爛，一般減產(chǎn)20%～30%，嚴(yán)重的高達(dá)50%以上，對(duì)番茄生產(chǎn)構(gòu)成極大威脅[1]。目前，在防治灰霉病上主要選用苯并咪唑類的多菌靈、甲基硫菌靈，二甲酰亞胺類的腐霉利，異菌脲以及N-苯氨基甲酸酯類的乙霉威等藥劑。長期單一的使用該類藥劑使得番茄灰霉病菌對(duì)其產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗藥性，同時(shí)加大劑量防治導(dǎo)致農(nóng)藥殘留的問題越來越嚴(yán)重[2～4]。因此，開發(fā)高效、低毒、低殘留的“環(huán)境和諧農(nóng)藥”（environment acceptably/friendly pesticides），有效防治番茄灰霉病已經(jīng)成為當(dāng)務(wù)之急[5]。

植物源農(nóng)藥由于對(duì)人畜安全無毒，對(duì)環(huán)境安全及對(duì)病蟲的殺傷特異性強(qiáng)等[6]，已受到社會(huì)的廣泛關(guān)注?？茖W(xué)研究工作者對(duì)其進(jìn)行了大量的研究，如我國曾以大蒜素分子結(jié)構(gòu)為模板衍生合成了乙蒜素，成功開發(fā)出“抑菌素401”和“抑菌素402”，用來防治甘薯黑斑病、小麥腥黑穗、棉花苗期病害等[7]；黃樂平等[8]通過對(duì)新疆幾十種植物抑菌活性的測定，發(fā)現(xiàn)了7種植物對(duì)黃瓜霜霉病有較好的防效，并進(jìn)一步對(duì)其中的4種植物抑菌活性研究后，復(fù)配出抗病增產(chǎn)劑I號(hào)、Ⅱ號(hào)、Ⅲ號(hào)；孟昭禮等[9]經(jīng)過對(duì)銀杏抑菌活性十幾年的潛心研究，現(xiàn)已通過仿生合成開發(fā)出“綠帝乳油”，并已經(jīng)獲得專利。另外，還采用人工模擬技術(shù)合成一種農(nóng)用殺菌劑銀泰。Dev U等[10]研究發(fā)現(xiàn)，植物芳香成分中的丁子香酚、甲基丁子香酚、檸檬醛、2-苯乙醇等6種化合物對(duì)5種種子病原真菌的菌絲生長有強(qiáng)烈的抑制作用，在植物病害防治和檢疫中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

因此，對(duì)植物進(jìn)行殺菌活性篩選，尋找具有高效殺菌活性的特有植物，對(duì)探索結(jié)構(gòu)新穎的可直接應(yīng)用于農(nóng)業(yè)病害防治或進(jìn)行仿生合成尋找先導(dǎo)化合物，具有重要意義。本研究對(duì)42種藥用植物甲醇提取物對(duì)番茄灰霉病進(jìn)行了生物測定，為從植物中分離出對(duì)番茄灰霉病具有高活性的化合物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

②供試植物材料 除峨眉菝葜采自峨眉山之外，其余41種植物均采自重慶金佛山國家自然保護(hù)區(qū)。品種如下：蛇足石杉（Thunb.ex Murray）峨眉菝葜、檫木海南五針?biāo)蓭r木瓜Corner）、珍珠蓮Oliv.）Corner）、南川木菠蘿

③供試溶劑 丙酮（AR級(jí)），甲醇（AR級(jí)），無菌水。

④供試儀器 DHG-9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，LDZX-50FA立式電熱壓力蒸汽滅菌器，SPX生化型培養(yǎng)箱，F(xiàn)Z-102型粉碎機(jī)，EYELA-1000型濃縮儀，DPH-6123型真空干燥箱，CP224S電子分析天平。

1.2 試驗(yàn)方法

①植物樣品前處理與活性物質(zhì)的提取a.植物樣品的干燥與粉碎。將采集的各種樣品約500 g自然風(fēng)干，再利用真空干燥箱干燥，箱內(nèi)溫度為55℃，壓力為0.05 Pa，直到植物樣品完全干燥為止。用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，得到60目（孔徑0.246 mm）篩的植物樣品粉末備用。

b.植物甲醇提取物的提取。采用冷浸法進(jìn)行提?。悍Q取50 g供試植物干粉裝入大型廣口瓶 （體積1000 mL）中，然后加入500 mL甲醇進(jìn)行提取，5 d后濾出浸提液，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮。采用以上方法再重復(fù)提取2次，合并所得的甲醇浸膏，稱重存儲(chǔ)于冰箱中備用[11]。

②植物甲醇提取物的抑菌活性篩選 采用菌絲生長速率抑制法[7]。分別準(zhǔn)確稱取每種植物甲醇浸膏0.5 g溶解于2 mL丙酮中，然后加無菌水至10 mL，配成50 mg/mL母液，用20 W紫外燈照射30 min備用。配制母液過程中，如果浸膏溶解性不好，可加入2～3滴吐溫80進(jìn)行攪拌，同時(shí)輔助超聲波處理10 min增加其溶解性，形成均一穩(wěn)定的藥液備用。

用1 mL的移液管取1 mL母液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中（Φ=9.0 cm），然后用10 mL移液管移取9 mL熔融培養(yǎng)基（50～60℃）到培養(yǎng)皿，形成5 mg/mL的含毒培養(yǎng)基，對(duì)照為0.2 mL丙酮+0.8 mL無菌水+9 mL培養(yǎng)基，每處理重復(fù)3次。最后在冷卻培養(yǎng)基表面接種菌餅（Φ=0.5 cm），然后放入28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，72 h后采用“十”字交叉法測定菌落直徑。

③抑菌活性較好的提取物對(duì)番茄灰霉病毒力的測定 每個(gè)提取物設(shè)置5個(gè)濃度梯度處理，其余同②。

④數(shù)據(jù)處理 計(jì)算各處理抑制率。將濃度轉(zhuǎn)化為濃度常用對(duì)數(shù)，抑制率轉(zhuǎn)化為幾率值，建立毒力回歸方程（=a+b），求出毒力及95%的置信區(qū)間。

抑制率（%）=[（對(duì)照菌落擴(kuò)展直徑-處理菌落直徑）/（對(duì)照菌落直徑-0.5×菌餅直徑）]×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 42種植物甲醇提取物對(duì)番茄灰霉病菌的生物活性

試驗(yàn)結(jié)果表明，心籽絞股藍(lán)、海南五針?biāo)杉八R桑對(duì)番茄灰霉病菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性，其抑制率分別為83.68%，76.21%及60.88%，且與其余處理差異顯著；在試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)有些植物提取物對(duì)菌絲不但沒有抑制作用，反而還具有促進(jìn)作用，比較顯著的是金線草，其抑制率為-22.55%；其次為冬桃（枝葉），為-14.40%，川牛膝也達(dá)到了-11.66%（表1）。

2.2 抑菌活性較好的提取物對(duì)番茄灰霉病毒力測定

表1 42種植物甲醇提取物對(duì)番茄灰霉病的抑菌活性

毒力測定結(jié)果表明，心籽絞股藍(lán)、海南五針?biāo)杉八R桑對(duì)番茄灰霉病的分別為1.000 mg/mL，3.275 mg/mL和5.050 mg/mL（表2）。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

通過測定42種植物甲醇提取物對(duì)番茄灰霉病的生物活性，篩選出心籽絞股藍(lán)、海南五針?biāo)?、水馬桑對(duì)番茄灰霉病具有較好的抑制作用，其抑制率均達(dá)到60%以上；通過對(duì)這3種植物提取物進(jìn)行毒力測定，其有效中濃度分別為：心籽絞股藍(lán)1.000 mg/mL、海南五針?biāo)?.275 mg/mL、水馬桑5.050 mg/mL。綜合以上結(jié)果表明，心籽絞股藍(lán)對(duì)番茄灰霉病的抑菌效果最好。

3.2 討論

本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)某些植物甲醇提取物對(duì)番茄灰霉病菌有促進(jìn)作用，如在5 mg/mL濃度下，金線草、冬桃（枝葉）及川牛膝的提取物對(duì)番茄灰霉病菌的抑制率分別為-22.55%，-14.40%及-11.66%。針對(duì)這種情況，其原因可能是在植物中同時(shí)存在抑菌、促菌2類活性物質(zhì)。隨著濃度的降低，其抑菌、促菌活性物質(zhì)比例不同，導(dǎo)致結(jié)果不同[12]。但具體原因目前還未見報(bào)道，值得進(jìn)一步研究。

心籽絞股藍(lán)是葫蘆科絞股藍(lán)屬多年生攀緣草本植物。有相關(guān)研究表明同屬植物絞股藍(lán)具一定的廣譜抗菌活性[13]，其主要成分為皂苷、多糖、黃酮類化合物、有機(jī)酸和微量元素等多種化學(xué)成分[14]。廣泛研究表明，皂苷與黃酮類化合物具有較強(qiáng)的抑菌活性，如空心蓮子草皂苷類物質(zhì)對(duì)細(xì)菌和真菌均有一定程度的抑制作用，對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、黑曲霉和根霉有明顯的抑菌作用[15]；水溶性海參皂苷對(duì)黃瓜枯草病原菌和葡萄炭疽病菌，以及黑曲霉菌也具有顯著的抑菌活性[16]；節(jié)節(jié)草地上部含有豐富的黃酮類化合物，其對(duì)大腸桿菌和八疊球菌等有明顯的抑制作用[17]；苦參中黃酮類化合物也對(duì)細(xì)菌和真菌有抑制作用[18]。所以，心籽絞股藍(lán)對(duì)番茄灰霉菌表現(xiàn)出抑菌效果，可能與該種植物中含有豐富的黃酮和皂苷類次生代謝物質(zhì)有關(guān)，但活性物質(zhì)的分離和結(jié)構(gòu)的鑒定還需要進(jìn)一步深入研究。

表2 3種植物甲醇提取物對(duì)番茄灰霉病菌的毒力測定

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Preliminary Studies on the Antifungal of 42 Medical Plant Species Methanol Extracts against

The antifungal activities of 42 species medical plant methanol extracts were tested on thePers. with a growth rate method.The results showed that the antifungal activities against thePers.ofCogn.ex Oliv.,Hand.-Mazz.andWall.(5 mg/mL)were better than other treatments,and the inhibition rates were 83.68%,76.21%,60.88%,respectively.Also deeply detected the toxicities of three plants againstPers.and theof them were 1.000 mg/mL,3.275 mg/mL and 5.050 mg/mL.So G. cardiospermum Cogn.ex Oliv.has shown good antifungal activity against thePers.and the active ingredients would be worthy of further study.

Pers.;Plant methanol extracts;Cogn.ex Oliv.;Antifungal activity

WANG Xuegui1,2,WU Zhihua2,SHEN Litao1,TIAN Yongqing1

10.3865/j.issn.1001-3547.2009.18.028

王學(xué)貴（1976-），男，博士研究生，講師，主要從事植物源農(nóng)藥研究。E-mail:wanderwxg@sican.edu.cn

2009-03-10