楊　揚　何勝江　吳　凱　李興美　付婷婷

摘要高羊茅在我國有著廣泛的種植面積，是多年生冷季型牧草和草坪草。介紹了高羊茅的再生體系，從它的轉(zhuǎn)化方法、轉(zhuǎn)化目標、影響因素、生物安全問題等方面綜述了高羊茅的外源基因轉(zhuǎn)化研究進展。

關(guān)鍵詞高羊茅；再生體系；遺傳轉(zhuǎn)化；影響因素；展望

中圖分類號S688.4文獻標識碼A文章編號 1007-5739(2009)01-0042-03

高羊茅又名葦狀羊茅，屬于禾本科羊茅屬，原產(chǎn)于歐洲西部，我國在20世紀70年代引進，現(xiàn)已是世界溫帶地區(qū)建立人工草地和補播天然草場的重要草種[1]。高羊茅是多年生疏叢型禾草，其具有耐旱耐濕耐熱、生長迅速、再生性強等特點，隨著我國人工草地建植的不斷發(fā)展，其建植面積正在不斷地擴大。

高羊茅在我國具有廣泛的氣候和土壤環(huán)境適宜性，大部分地區(qū)均可種植。它屬于多年生冷季常綠型，生長期達8～10個月，可充分利用太陽輻射，耐瘠薄，在黏至砂質(zhì)土壤上均表現(xiàn)良好。但是，高羊茅在抗旱性、耐寒性方面還需要進一步提高。利用常規(guī)育種技術(shù)耗時周期長，效率差，存在很多的局限性。利用基因工程技術(shù)即將抗逆功能基因有目的、有針對性地導(dǎo)入特定品種的愈傷組織或原生質(zhì)體，獲得改良的轉(zhuǎn)基因植物[2]，如利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育抗旱節(jié)水、耐寒的高羊茅新品種就是目前研究的熱點。

建立高效的組織培養(yǎng)體系是植物遺傳轉(zhuǎn)化的先決條件，高羊茅組織培養(yǎng)方面的研究開始于20世紀80年代，1979年Lowe和Conger從高羊茅成熟種子胚成功地誘導(dǎo)愈傷組織并得到再生植株。此后，人們通過花粉囊培養(yǎng)、幼穗培養(yǎng)、從懸浮培養(yǎng)細胞獲得原生質(zhì)體的培養(yǎng)和成熟種子誘導(dǎo)愈傷的培養(yǎng)等都獲得了再生植株。

1高羊茅再生體系

高羊茅等羊茅草種的組織培養(yǎng)開始于20世紀70年代，Dale首先從高羊茅的分生組織頂端培育出小植株[3]，其后，隨著研究的不斷深入，愈傷組織再生系統(tǒng)、懸浮細胞再生系統(tǒng)、原生質(zhì)體再生系統(tǒng)等各種途徑的高羊茅再生體系相繼建立。

1.1愈傷組織再生系統(tǒng)

對于單子葉植物高羊茅來說，選用愈傷組織再生系統(tǒng)是最為理想的，因為單子葉植物懸浮系的建立和原生質(zhì)體的再生十分困難，而由器官直接分化再生植株難度更大[4]。目前通過對高羊茅不同外植體（如成熟種子、成熟胚、幼胚、幼穗、節(jié)外植體、葉片基部的切片、分生組織及花梗組織等）的誘導(dǎo)已經(jīng)獲得了愈傷組織并建立了相關(guān)的再生體系[5]。

基因型是影響高羊茅愈傷組織誘導(dǎo)與植株再生的一個重要因素。Eizenga等[6]在對高羊茅研究過程中發(fā)現(xiàn)不同品種之間愈傷組織誘導(dǎo)率及其再生頻率有顯著差異，而且產(chǎn)生愈傷組織最多的基因型未必再生植株最多。Bai等[7]對美國多個高羊茅常見品種進行了比較研究，愈傷誘導(dǎo)率變幅在16.7％～58.8％，分化成苗率1％～22％，并且發(fā)現(xiàn)愈傷組織誘導(dǎo)率低的品種，愈傷組織再生頻率不一定低。王維飛在研究高羊茅愈傷組織及植株再生過程中認為不同基因型因其內(nèi)源激素是不同的，故基因型對愈傷組織誘導(dǎo)存在影響。

在常用的植物組織培養(yǎng)基本培養(yǎng)基類型中，高羊茅組織培養(yǎng)采用最多的基本培養(yǎng)基是MS。將不同的植物激素、有機物或其他物質(zhì)添加到培養(yǎng)基中可以改變愈傷組織的誘導(dǎo)率。與其他禾本科草不同，高羊茅成熟種子誘導(dǎo)愈傷組織需要較高濃度的植物生長物質(zhì)2，4-D[8]。2，4-D是誘導(dǎo)高羊茅外植體形成愈傷組織的關(guān)鍵因素[4]，最佳2，4-D濃度是5～9mg／L[7，9]，高于12mg／L或低于2mg／L則對愈傷組織的誘導(dǎo)有強烈抑制作用[10]。

1.2胚性懸浮細胞再生系統(tǒng)

禾本科植物懸浮細胞的植株再生比較困難，高羊茅也不例外[11]。胚性懸浮細胞系作為分離原生質(zhì)體的來源，已經(jīng)廣泛用于體細胞雜交和遺傳轉(zhuǎn)化[12]，高羊茅胚性懸浮細胞系的建立，為高羊茅原生質(zhì)體培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化提供了一個極好的體系[13]。相較于愈傷組織再生系統(tǒng)，由高羊茅胚性懸浮培養(yǎng)細胞再生植株的工作在20世紀80年代后期已取得成功[14]，Dalton等[15]采用碳化纖維法轉(zhuǎn)化高羊茅細胞懸浮物，獲得了轉(zhuǎn)基因植株。在已報道的高羊茅懸浮細胞再生分化的研究中，大多存在著綠苗再生頻率低、白化苗發(fā)生率高的問題，胡張華等[16]在試驗過程中認為用經(jīng)2.5mg/L CuSO4·5H2O篩選出的胚性愈傷組織在短期內(nèi)建立穩(wěn)定的高質(zhì)量胚性懸浮細胞系是研究成功的前提；而將懸浮細胞進行高滲處理并結(jié)合高濃度瓊脂培養(yǎng)是試驗成功的關(guān)鍵[16]。

1.3原生質(zhì)體再生系統(tǒng)

自從1960年英國學(xué)者Cocking用酶法首次從番茄根尖分離出大量有活性的原生質(zhì)體，并通過培養(yǎng)再生細胞壁以來，人們對植株原生質(zhì)體的分離和培養(yǎng)進行了廣泛地探索[17]。原生質(zhì)體可用于直接基因轉(zhuǎn)移和融合，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植株和體細胞雜種[18]。據(jù)研究報道，從高羊茅細胞懸浮細胞培養(yǎng)系分離的原生質(zhì)體可以分成4類，即含有大淀粉粒（5～10μm）的具液泡原生質(zhì)體、含有小淀粉粒（2μm）的具液泡原生質(zhì)體、只具液泡的原生質(zhì)體和沒有可見液泡的小而細胞質(zhì)稠密的原生質(zhì)體[19]。Takamizo[20]等將碘乙酰胺失活的高羊茅原生質(zhì)體與非形態(tài)發(fā)生的意大利黑麥草原生質(zhì)體電融合，并再生獲得了若干綠色植株[20]。

2外源基因的遺傳轉(zhuǎn)化

2.1轉(zhuǎn)化方法

迄今為止，利用基因工程技術(shù)把外源基因?qū)胫参锛毎麖亩鴮崿F(xiàn)基因轉(zhuǎn)化方法的技術(shù)主要包括PEG法、電激法、硅碳纖維法、基因槍法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。Wang等[21]1992年用PEG法以懸浮細胞系為受體，獲得了轉(zhuǎn)Hpt和Bar基因的轉(zhuǎn)基因高羊茅；Ha等[22]1992年以胚性細胞為受體通過電激融合法獲得了轉(zhuǎn)Hpt和Gus基因的轉(zhuǎn)基因高羊茅；Dalton等[23]1998年首次采用硅碳纖維轉(zhuǎn)導(dǎo)法轉(zhuǎn)化高羊茅細胞懸浮培養(yǎng)物，獲得了轉(zhuǎn)基因植株；Spangenberg等[24]1995年通過基因槍法以胚性懸浮系為受體獲得了轉(zhuǎn)Gus基因的高羊茅[24]；Bettany等[25]2003年通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法以胚性懸浮細胞為受體獲得了轉(zhuǎn)Hpt和Gus基因的2個獨立轉(zhuǎn)基因株系的高羊茅[25]。

2.2轉(zhuǎn)化的主要目標

早期的高羊茅轉(zhuǎn)基因研究的主要是為了建立遺傳轉(zhuǎn)化體系，因此所轉(zhuǎn)的外源基因只局限于選擇基因Hpt（潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因）和Bar（膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因）以及報告基因Gus（葡糖苷酸酶基因）[26]。目前的轉(zhuǎn)化目標主要包括以下幾個方面。

2.2.1改良高羊茅的品質(zhì)。作為牧草型用的高羊茅，提高它的干物質(zhì)消化率以利于動物吸收，從而改善動物的適口性和其品質(zhì)與營養(yǎng)價值，采用基因工程育種技術(shù)能比傳統(tǒng)的育種技術(shù)更快的達到目的。Wang等[27]在2001年將向日葵清蛋白SFA8與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號KDEL轉(zhuǎn)入了高羊茅，使轉(zhuǎn)基因植株中SFA8蛋白含量占總?cè)艿鞍椎?.2%，比未轉(zhuǎn)基因植株的0.01%提高了許多。SFA8含有23%的甲硫氨酸和半胱氨酸，這2種含硫氨酸都屬于反芻動物營養(yǎng)中最為限制性的必需氨基酸，將此基因?qū)肽敛菪透哐蛎?，表達產(chǎn)生含硫氨基酸豐富的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，對提高動物生產(chǎn)率具有重要意義。

2.2.2獲得抗除草劑性能。隨著城市經(jīng)濟的快速發(fā)展，草坪草在城市環(huán)境美化、綠化扮演著越來越重要的角色，化學(xué)除草劑因此得以廣泛地應(yīng)用。目前使用的化學(xué)除草劑大多屬于高毒高污染的化學(xué)藥品，它的大量使用將會嚴重污染土壤、地下水，揮發(fā)到空氣中還可污染空氣，同時還會破壞生態(tài)系統(tǒng)。生物除草劑由此誕生，抗除草劑基因是其重要組成部分?？钩輨┗虻谋磉_以其特有的除草劑抗性特征，在植物基因工程技術(shù)中得以廣泛應(yīng)用，在很多遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中簡化了篩選過程。利用抗除草劑基因作為遺傳轉(zhuǎn)化篩選標記基因的研究報告有很多。Kuai等[28]1999年獲得具有可育性的轉(zhuǎn)基因高羊茅，對除草劑Glufosinate ammonium 有明顯的抗性。在以培育抗除草劑植物為目的的研究中，Wang等[29]1992年用抗除草劑基因（bar）轉(zhuǎn)化高羊茅原生質(zhì)體。

2.2.3提高抗逆性。植物的抗逆性是十分復(fù)雜的性狀，包括抗寒性、抗旱性、耐鹽性等，是多個基因來參與調(diào)控的?？鼓婊虻姆蛛x、克隆和轉(zhuǎn)化一直都是國內(nèi)外科學(xué)家研究的熱點。目前已經(jīng)分離出大量相關(guān)的基因，如抗寒有關(guān)的Mn-SOD基因等、抗旱有關(guān)的擬南芥CBF基因等、耐鹽有關(guān)的脯氨酸合成酶基因等。提高高羊茅的抗旱性，既可以降低它作為草坪草的管理費用，又能使它在干旱地區(qū)得以廣泛種植。任偉[30]通過根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)DREBIA基因轉(zhuǎn)化高羊茅獲得了抗旱性牧草株系。梁蕊芳[31]利用基因槍法將NHX1、CBF耐逆相關(guān)基因?qū)敫哐蛎┇@得了相關(guān)的抗性植株。

2.2.4提高抗病害性。病蟲害普遍存在于高羊茅的生產(chǎn)中，病蟲害多、分布廣，嚴重影響生產(chǎn)?；瘜W(xué)藥品的過度使用使得各病蟲害的耐藥性加強，而傳統(tǒng)的育種技術(shù)周期過長，無法滿足目前的生產(chǎn)需求。目前的抗蟲基因主要包括植物外援凝集基因、蛋白酶抑制基因和Bt基因?？共《净虻募夹g(shù)路線有：導(dǎo)入病毒外殼蛋白(Coat protein，CP)基因；利用病毒的衛(wèi)星RNA(Satellite RNA，Sat- RNA)；利用病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白基因，特別是復(fù)制酶—replicase 基因；利用人工構(gòu)建的缺損干擾顆粒(Defective interfering particle)；利用植物本身編碼的抗病毒基因和利用動物中的干擾素(Interferon)基因；利用反義RNA 技術(shù)；利用中和抗體法技術(shù)；設(shè)計核酶剪切病毒RNA 等。在這些技術(shù)路線中，導(dǎo)入CP基因是目前最為成功的一種[32]。

2.3 遺傳轉(zhuǎn)化的影響因素

2.3.1篩選方法的選用。目前，在植物遺傳轉(zhuǎn)化中常用的選擇標記大多用抗生素作為篩選標記基因，主要有以下類型：新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(NptII基因，具有抗卡那霉素或G418 特性)、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(Hpt基因，具有抗潮霉素特性)、除草劑轉(zhuǎn)移酶基因(Bar基因，提供對除草劑Basta的抗性)等[33]。在高羊茅的遺傳轉(zhuǎn)化中，研究人員大多采用潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因篩選，簡單不連續(xù)篩選時，植株再生最多，但導(dǎo)致大量逃逸植株的產(chǎn)生；而采用低濃度潮霉素連續(xù)篩選，雖然一些未轉(zhuǎn)化愈傷組織能夠存活和生長，但不能再生植株，因而產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植株數(shù)最多且沒有逃逸[34]。

2.3.2抗生素的使用。農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法在高羊茅的遺傳轉(zhuǎn)化中已獲得了成功，在篩選轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基中需要加入抗生素以殺滅農(nóng)桿菌。高羊茅的研究中常使用頭孢霉素與羧芐青霉。吳關(guān)庭等[35]在研究抗生素對高羊茅胚性愈傷組織生長與分化的影響時發(fā)現(xiàn)頭孢霉素明顯抑制愈傷組織生長，而濃度低于500mg／L的羧芐青霉素能促進愈傷組織生長；2種抗生素對愈傷組織分化均有抑制作用，但羧芐青霉素的抑制作用要比頭孢霉素小。

2.3.3培養(yǎng)時間。采用胚性細胞懸浮物為再生系統(tǒng)時，懸浮物培養(yǎng)時間對高羊茅再生植株影響明顯。Kuai和Morris (1995)[41]研究表明，用于分離原生質(zhì)體的細胞培養(yǎng)物的繼代保存時間和分離前的繼代培養(yǎng)時間對Gus基因的瞬間和穩(wěn)定表達有顯著影響。隨著懸浮培養(yǎng)物繼代保存時間的延長，一方面，正如前面所指出的那樣，植株再生能力下降，白苗增多，另一方面，Gus基因瞬間表達水平和穩(wěn)定表達頻率逐漸降低。使用從繼代培養(yǎng)3～4d的懸浮培養(yǎng)物分離的原生質(zhì)體，其Gus基因瞬間表達水平最高，而使用從繼代培養(yǎng)1d和7d的懸浮培養(yǎng)物分離的原生質(zhì)體，其Gus基因瞬間表達水平還不到其1/2。原生質(zhì)體分離前的繼代培養(yǎng)時間對Gus基因瞬間表達的影響與細胞培養(yǎng)物的生長率和蛋白合成速率密切相關(guān)。

2.3.4植物激素。激素是細胞、組織培養(yǎng)中除了遺傳因素之外非常重要的因素，并且非常難掌握。對禾本科草類而言，起主要作用的是生長素類、分裂素類和脫落酸類，應(yīng)用于高羊茅的也主要是這3類激素。高羊茅在組織誘導(dǎo)中需要高濃度的2，4－D，最適濃度為9.0mg/L[36]；6－BA的使用濃度為1.0～3.0mg/L[37]；在高羊茅懸浮細胞系的建立及綠色植株的高頻再生的研究中發(fā)現(xiàn)，不同濃度的ABA對高羊茅成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)率有顯著影響，以ABA為2.0mg/L時的誘導(dǎo)率最高，且可有效抑制胚芽和根的生長，顯著提高其成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)率[16]。

2.3.5污染及白化苗問題。高羊茅在組織培養(yǎng)過程中污染現(xiàn)象遠遠高于其他草種，且愈傷組織誘導(dǎo)率一直很低。后有研究者發(fā)現(xiàn)這與高羊茅體內(nèi)共生的頂孢霉素真菌有關(guān)。Samposon于1933年首次報道了禾本科牧草葉鞘組織內(nèi)有真菌存在。李劍等[40]在檢測高羊茅種子內(nèi)生真菌的研究中，所測的7個樣品有4個品種都含有內(nèi)生真菌，且獵狗5號品種帶菌率達80%?，F(xiàn)在研究人員常采用不同的種子處理方法以減少內(nèi)生真菌對組織誘導(dǎo)的影響。高羊茅再生植株白化現(xiàn)象在組織培養(yǎng)中普遍存在，問題很突出。在Rajoelina等[38]1990年的研究中，15%的高羊茅愈傷組織完全再生白化植株，另有18%的愈傷組織同時再生白苗和綠苗。Takamizo等[39]1990年再生獲得188個原生質(zhì)體來源的高羊茅植株，其中白化苗多達145個，占77.1%。

2.4遺傳轉(zhuǎn)化生物安全問題

作為牧草型用的高羊茅，在日常使用過程中，由于缺乏適度修剪常導(dǎo)致開花結(jié)實，花粉通過自然或人為因素的傳播引發(fā)潛在的生物安全問題，特別是抗除草劑基因的轉(zhuǎn)入存在向野生雜草轉(zhuǎn)移的可能。但不少研究者認為草類植物異交率很低，種間雜交情況很少[42]。作為草坪型用的高羊茅在城市綠化中通常是通過適當?shù)男藜暨M行養(yǎng)護管理，不會存在開花結(jié)實的問題。無論怎樣，轉(zhuǎn)基因植物的生物安全仍然是全世界普遍關(guān)注的問題之一，對轉(zhuǎn)基因植物的安全性評價主要集中在2個方面，一個是環(huán)境安全性，另一個是食品安全性。目前很多國家都已制定了各自對轉(zhuǎn)基因生物的相關(guān)管理法規(guī)，對其安全性進行評價和監(jiān)控。

3展望

高羊茅的遺傳轉(zhuǎn)化是21世紀草坪草和牧草轉(zhuǎn)基因研究的一個熱點。自20世紀80年代以來，我國農(nóng)業(yè)生物基因工程技術(shù)迅速發(fā)展，到目前為止，高羊茅遺傳轉(zhuǎn)化研究已經(jīng)建立了多套轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系，取得了較大進展。高羊茅作為我國主要應(yīng)用的草坪草和牧草草種之一，仍存在巨大潛力空間，但所需的草種基本依靠國外進口，培育適合我國本土環(huán)境生長需求的新品種勢在必行。雖在研究過程中面臨種種困難，但隨著農(nóng)業(yè)生物工程基因技術(shù)的發(fā)展，問題將逐一解決。迄今為止，高羊茅已有子代轉(zhuǎn)基因遺傳穩(wěn)定性的研究，而大部分其他種類還僅局限于轉(zhuǎn)化研究階段，這也將極大促進高羊茅遺傳轉(zhuǎn)化的更快速發(fā)展。

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