張燕青 曾園山 何留民 全大萍 李燕

聚左旋丙交酯納米纖維支架與大鼠脊髓組織相容性的研究

張燕青 曾園山 何留民 全大萍 李燕

目的探討聚左旋丙交酯[Poly(l-lactic acid)，PLLA]納米纖維支架與大鼠脊髓組織的相容性。方法以PLLA為原料，采用液-液相分離技術構(gòu)建納米纖維支架(Nanofibrous scaffolds)。在體外構(gòu)建骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)-PLLA納米纖維支架復合體；將12只SD大鼠隨機分為兩組，即損傷對照組和MSCs移植組。暴露大鼠胸10脊髓段做半橫斷損傷，其中在損傷對照組脊髓損傷處移植PLLA納米纖維支架，在MSCs移植組脊髓損傷處移植MSCs-PLLA納米纖維支架復合體。術后兩組動物觀察60 d。HE染色觀察結(jié)構(gòu)改變，免疫組織化學方法觀察炎癥細胞及MSCs的存活情況。結(jié)果體外成功構(gòu)建MSCs-PLLA納米纖維支架復合體。掃描電鏡顯示，PLLA納米纖維支架由相互貫穿的微孔組成。熒光顯微鏡和掃描電鏡下均可見MSCs能夠很好地黏附在支架上，分布較均勻。移植術后60 d，HE染色顯示，PLLA納米纖維支架與脊髓組織融合較好，無明顯空洞和瘢痕。CD68免疫組織化學顯示，在移植物與宿主脊髓交界處有少量陽性細胞，表明有輕微炎癥反應。GFP免疫組織化學顯示，移植在脊髓損傷處的PLLA納米纖維支架內(nèi)有大量陽性MSCs，表明MSCs在移植術60 d仍有存活。結(jié)論PLLA納米纖維支架與大鼠脊髓組織有較好的生物相容性。

聚左旋丙交酯納米纖維支架骨髓間充質(zhì)干細胞脊髓損傷生物相容性

治療脊髓損傷一個重要的策略，就是移植一種橋梁支架物，以使軸突再生并穿越損傷區(qū)域[1-2]。聚左旋丙交酯[Poly(l-lactic acid)，PLLA]是組織工程中最常用的合成生物材料之一，無毒，可生物降解[3]。具有納米纖維結(jié)構(gòu)的支架可以在結(jié)構(gòu)上模仿天然細胞外基質(zhì)，為細胞和組織提供良好的環(huán)境[4]。我們以前的研究證實，PLLA納米纖維支架在體外與MSCs有良好的生物相容性[5]，而與脊髓組織的相容性尚不清楚。因此，我們在體外構(gòu)建MSCs-PLLA納米纖維支架復合體，移植到大鼠損傷的脊髓組織內(nèi)，探討PLLA納米纖維支架和脊髓組織的相容性，為應用組織工程技術修復脊髓損傷提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑、儀器

健康雌性SD大鼠12只(由中山大學實驗動物中心提供)，體重250～300 g；10 d齡新生SD乳鼠；CD68抗體(Sigma)、EGFP抗體(Sigma)、山羊抗小鼠FITC(Jackson ImmunoResearch)、L-DMEM(Gibco)，胎牛血清(TBD，Zhanchen)；熒光顯微鏡(Leica)，恒冷箱切片機(Leica)，掃描電子顯微鏡(JSM-6380LA，JEOL)。

1.2 納米纖維支架的制備

以PLLA（特性黏度為1.75 dl/g）為原料，采用液-液相分離技術構(gòu)建納米纖維支架（Nanofibrous scaffolds）。方法：將一定量的PLLA溶解在二氧六環(huán)/水混合溶劑中，得到質(zhì)量濃度為5%的澄清溶液，然后迅速將其倒入處理過的25 mL小燒杯中，置于12℃使其凝膠化2 h；之后，連同燒杯于-40℃淬火2 h；最后，于0℃、0.940 mbar冷凍干燥4 d，得到支架。

1.3 骨髓間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)與純化

脫頸處死10 d齡SD乳鼠(轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白基因的大鼠)，無菌條件下取其股骨，用含10%胎牛血清的L-DMEM沖洗骨髓腔，收集骨髓細胞懸液。用吸管輕輕吹打成單細胞懸液，將細胞接種到鋪有多聚賴氨酸的培養(yǎng)瓶中，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第3天半量換液,以后2～3 d全量換液。大約10 d，當細胞接近融合(70%～80%)時按1∶3比例傳代（P1）。同樣方法傳代至第5代（P5）。

1.4 體外構(gòu)建MSCs-PLLA納米纖維支架復合體

將制備得到的PLLA納米纖維支架材料切割為1.5 mm×1.5 mm×2 mm大小后，以75%乙醇消毒5 min，然后用0.01 mil/L的PBS洗3遍。將MSCs制備成1×107cells/mL的細胞懸液。PLLA納米纖維支架上鋪放消毒好的濾紙，接種500μL細胞懸液于PLLA納米纖維支架上，利用虹吸原理使MSCs均勻分布，然后置于含10%胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)3 d后，用4%多聚甲醛固定支架材料，冰凍切片（厚度為30 μm），封片后在熒光顯微鏡下觀察。同時，以2.5%戊二醛固定后，梯度乙醇和丙酮脫水，乙酸異丙酯置換，臨界點干燥，表面噴金后掃描電鏡觀察。

1.5 制備半橫斷脊髓損傷模型

12只SD雌性大鼠隨機分為兩組，即損傷對照組和MSCs移植組。用1%戊巴比妥鈉(35 mg/kg)腹腔注射麻醉，消毒，切開皮膚，分離肌肉，切除T8和T9脊柱椎板并暴露脊髓，暴露T10脊髓段。在手術顯微鏡下，用虹膜剪將其表面的硬脊膜縱向剪開，接著橫向剪斷T10脊髓的右半側(cè)。損傷對照組在橫斷處填入PLLA納米纖維支架；MSCs移植組植入培養(yǎng)3 d的MSCs-PLLA納米纖維支架復合體，然后逐層縫合肌肉和皮膚。所有手術操作均于無菌條件下和手術顯微鏡下進行，術后所有動物腹腔內(nèi)注射青霉素，連續(xù)3 d。

1.6 灌注、固定和取材

術后60 d，用1%的戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠，開胸，經(jīng)左心室主動脈插管，用血管沖洗液200 mL（每100 mL含0.9%NaCl 0.2 mL、1%亞硝酸鈉0.2 mL、肝素200 IU）快速沖洗血管后，再用4%多聚甲醛400 mL固定。取T8～T12脊髓段，用新鮮的4%多聚甲醛后固定4 h，再置于30%蔗糖溶液中浸泡至組織下沉到瓶底。用恒冷箱冰凍切片機做T8～T12脊髓段連續(xù)縱切片，厚度為25μm，HE染色，光鏡觀察。

1.7 免疫組織化學染色

將MSCs移植組大鼠T8～T12節(jié)段脊髓縱切片行GFP的免疫熒光組織化學染色。脊髓切片用0.01 mol/L PBS漂洗后，10%正常山羊血清在37℃孵育30 min，甩去血清，直接滴加一抗：GFP(1∶300)。4℃孵育過夜。棄去一抗，PBS充分漂洗（3次，每次5 min）后再加入1%的山羊抗小鼠FITC二抗，37℃孵育1 h。棄二抗，PBS充分漂洗(3次，每次5 min)后用熒光封片劑封片（含60%甘油的PBS）。上述的血清和抗體均用含有0.2%Triton X-100的0.01 mol/L PBS（pH 7.4）配制。同時，以不加一抗為陰性對照。同上，行CD68免疫組織化學染色，DAB染色，蘇木素復染，中性樹膠封片，光鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 PLLA納米支架形貌

采用改進的液-液相分離技術，從PLLA/二氧六環(huán)/水三元體系制備得到同時具有微/納米尺度的PLLA三維多孔支架（圖1），大孔孔徑為（50±25）μm且相互貫穿，微孔孔壁由納米纖維構(gòu)成，纖維直徑為50～200 nm。

2.2 培養(yǎng)的MSCs形態(tài)變化

細胞接種后4～6 h，可見有圓形、透亮的細胞貼壁；培養(yǎng)第2天，細胞聚集形成克隆，且由克隆中開始伸出突起；第4天半量換液后，細胞形態(tài)變?yōu)殚L梭形、成纖維細胞樣或多角形，呈放射狀，形成小集落。隨著細胞的傳代，細胞也逐漸趨于純化。當傳到第3代時，細胞形態(tài)較均一，多為長梭形或紡錘狀（圖2）。細胞接種的1～5 d，細胞處于生長靜息期，增殖較慢，傳代后細胞開始大量增殖，進入快速增殖期。MSCs的這種快速增殖可維持到第5～6代。

2.3 MSCs在PLLA納米纖維支架上生長情況

體外構(gòu)建MSCs-PLLA納米纖維支架復合體。培養(yǎng)3 d后發(fā)現(xiàn)，發(fā)出綠色熒光的MSCs黏附生長在PLLA納米纖維支架內(nèi)，呈長梭形的細胞與其生長在培養(yǎng)板時的形態(tài)沒有明顯改變（圖3a）；同時掃描電鏡顯示，MSCs-PLLA納米纖維支架復合體內(nèi)表面較為粗糙，具有豐富的微孔隙，MSCs能夠很好地黏附在支架上，呈鋪展式生長。多數(shù)MSCs呈梭形、多角形等不規(guī)則形態(tài)，伸出多個小突起，突起輪廓較清晰，通過支架孔隙，細胞間的突起彼此連接(圖3b)，MSCs相互連接成片，形成一層細胞，多個細胞相互接觸形成網(wǎng)狀，分布較均勻（圖3c）。

2.4 MSCs－PLLA納米纖維支架復合物體內(nèi)移植及與宿主脊髓組織的生物相容性

移植至大鼠體內(nèi)60 d后，損傷對照組和MSCs移植組之間形態(tài)學上差異不大，取材時均發(fā)現(xiàn)PLLA納米纖維支架與脊髓移植處宿主組織整合良好，不易分離，支架開始有部分降解；脊髓縱切片HE染色示，復合物與宿主脊髓組織相容性好（圖4a），脊髓橫斷處未見明顯瘢痕和空洞，僅可見較小的囊腔或裂隙存在，與宿主的整合較好，損傷區(qū)可見未降解的PLLA納米纖維支架存在，在未降解的PLLA內(nèi)還可見新生的血管和宿主的細胞，可見少量的炎癥細胞。CD68是巨噬細胞的標記物，結(jié)果顯示各組均可以發(fā)現(xiàn)CD68陽性的細胞，主要集中在損傷區(qū)與宿主脊髓交界的區(qū)域內(nèi)，細胞體積比較大，胞漿棕黃色，顯示PLLA納米纖維支架無毒副作用，與脊髓組織有較好的生物相容性（圖4b）。

2.5 MSCs在宿主脊髓組織中的存活

將MSCs移植組的脊髓T8～T12節(jié)段縱切片在熒光顯微鏡下觀察，移植的MSCs是取自帶有GFP基因的大鼠，在脊髓損傷處及其脊髓損傷處的頭端和尾側(cè)端均有GFP抗體染色陽性（綠色）移植細胞。從分布上看，在脊髓損傷處(圖4c)以及與宿主脊髓組織交界處最多，分布得非常密集。在脊髓損傷處的頭端和尾側(cè)均有分布不均勻的細胞存在，而在遠離脊髓橫斷處的頭側(cè)和尾側(cè)端則沒有綠色熒光細胞。這表明移植到大鼠體內(nèi)60 d后，在PLLA納米纖維支架內(nèi)的MSCs能存活。

圖1 PLLA三維納米纖維支架（標尺：a=50μm；b=2μm）

圖2 體外培養(yǎng)的第3代轉(zhuǎn)染GFP基因的MSCs（標尺:40μm）

圖3 MSCs種植于PLLA納米纖維支架3 d

圖4 MSCs－PLLA納米纖維支架復合物體內(nèi)移植后與宿主脊髓組織的生物相容性良好

3 討論

組織工程材料已經(jīng)廣泛應用于外周神經(jīng)損傷修復并取得較滿意的效果[6-7]，但對中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復的研究還在探索過程中[8]。脊髓損傷后，生物或非生物支架可用來連接受損周圍神經(jīng)和脊髓遠、近斷端,誘導再生軸突沿著支架提供的通道從近端長入遠端。

種子細胞和支架材料是組織工程中兩個重要的要素。其中，種子細胞的選擇是關鍵問題之一。MSCs是骨髓中的一種具有自我增殖、多向分化潛能的細胞,在特定的條件下能分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞[9]。實驗證實，MSCs具有促進脊髓損傷后神經(jīng)元軸突生長的作用[10]。自體MSCs容易獲取，便于體外培養(yǎng)、擴增和純化，以達到組織工程要求的數(shù)量，應用其治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病不存在倫理學和免疫排斥等問題。因此，本研究選擇將MSCs作為組織工程人工神經(jīng)的種子細胞。

生物支架可以為細胞生長提供三維的機械支撐并引導細胞長入新的組織或器官。若沒有適當?shù)妮d體，種植的細胞就會流失死亡。所以，對性能優(yōu)良、生物相容性良好的聚合物支架的評價和篩選，已成為組織工程研究中的重要組成部分。在脊髓損傷的治療中，生物支架的主要作用是引導細胞的遷移、增殖、分化以及凋亡，且能通過防止瘢痕形成及聚集生長因子而促進神經(jīng)再生[11]。理想的支架材料應具備一定的降解速度、生物相容性和細胞親和性，使種子細胞能貼附并均勻地分布于支架內(nèi)。PLLA是一種無毒，可生物降解的高分子生物材料，并且具有良好的生物相容性，其降解最終產(chǎn)物為CO2和H2O，中間產(chǎn)物乳酸也是人體正常的糖代謝產(chǎn)物，目前已在多種組織工程領域中應用[12-13]。Matsumoto等[14]研究發(fā)現(xiàn)，PLLA合成膜在脊髓組織中有很好的生物相容性和快速的降解率，可以應用于脊髓手術。Li等[15]報道，多孔隙的PLLA導管表面積增加，不但可用于周圍神經(jīng)損傷的修復，對于脊髓損傷也有潛在的應用價值。最近，Hurtado等[16]將聚乳酸制成大孔徑的海綿狀支架，將種植于支架上的雪旺細胞植入脊髓損傷處，發(fā)現(xiàn)由于支架內(nèi)存活的雪旺細胞數(shù)量有限，影響了修復作用。因此，如何制備具有良好的生物相容性、能夠負載盡可能多細胞的支架成為組織工程研究的一個重點。

納米纖維支架具有較高的比表面積，可以吸附血清中的吸附蛋白從而增加細胞黏附。Ma等[17]首次利用液-液相分離技術成功地制備出了PLLA三維納米纖維支架，纖維直徑在50～500 nm之間。這種納米纖維支架在促進神經(jīng)元軸突生長[18]、選擇性地增加蛋白質(zhì)吸附[19]、促進成骨細胞分化和礦化方面[20]具有積極的意義。由PLLA/THF二元體系制備的納米纖維支架很難控制多孔結(jié)構(gòu)，需要在制備過程中加入致孔劑才能得到大孔或者微孔結(jié)構(gòu)[21]。我們首次通過PLLA/二氧六環(huán)/水三元體系，利用粗化效應制備具有微孔結(jié)構(gòu)和納米纖維網(wǎng)絡的三維PLLA納米纖維支架。微孔直徑為(50±25)μm，纖維直徑在50～200 nm之間，在結(jié)構(gòu)上模仿了天然細胞外基質(zhì)中的膠原纖維。該結(jié)構(gòu)可以裝載高深度的細胞懸液以植入體內(nèi)，且有利于大量的血管形成并長入支架內(nèi)，使得移植細胞能獲得充分的營養(yǎng)供給并利于代謝產(chǎn)物的排泄，以利于大量細胞生長并調(diào)節(jié)細胞和胞外基質(zhì)。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)，體外PLLA與MSCs有良好的生物相容性[9]，但是組織工程研究的最終目的，是將組織工程化的人工組織或器官應用于人體組織或器官的修復。因此，對支架材料體內(nèi)組織相容性的檢測具有重要意義，且是必要的。本研究中，我們將多孔PLLA納米纖維支架移植到大鼠脊髓半橫斷損傷處。術后60 d發(fā)現(xiàn)，在脊髓損傷處仍有部分未降解的支架，但硬度變軟，與宿主脊髓組織融合，無明顯大空洞和瘢痕，炎癥反應輕微。MSCs能在移植的支架內(nèi)以及支架與宿主脊髓交界處存活，并有部分遷移到宿主脊髓組織內(nèi)。因此，所制備的PLLA納米纖維支架與宿主脊髓組織有較好的生物相容性。

綜上所述，種植含有MSCs的PLLA納米纖維支架與大鼠脊髓組織具有較好的生物相容性，為脊髓損傷的修復重建提供了重要的實驗依據(jù)。

[1]Schwab ME,Bartholdi D.Degeneration and regeneration of axons in the lesioned spinal cord[J].Physiol Rev,1996,76(2):319-370.

[2]Guo J,Su H,Zeng Y,et al.Reknitting the injured spinal cord by self-assembling peptide nanofiber scaffold[J].Nanomedicine,2007,3 (4):311-321.

[3]Sinha VR,Khosla L.Bioabsorbable polymers for implantable therapeutic systems[J].Drug Dev Ind Pharm,1998,24(12):1129-1138.

[4]Smith LA,Ma PX.Nano-fibrous scaffolds for tissue engineering [J].Colloids Surf B Biointerfaces,2004,39(3):125-131.

[5]張燕青,曾園山,何留民,等.兩種高分子支架對骨髓間充質(zhì)干細胞生長的影響[J].組織工程與重建外科雜志,2007,3(6):305-308.

[6]Pierucci A,Duek EA,de Oliveira AL.Expression of basal lamina components by Schwann cells cultured on poly(lactic acid)(PLLA) and poly(caprolactone)(PCL)membranes[J].J Mater Sci Mater Med,2009,20(2):489-495.

[7]Bryan DJ,Holway AH,Wang KK,et al.Influence of glial growth factor and Schwann cells in a bioresorbable guidance channel on peripheral nerve regeneration[J].Tissue Eng,2000,6(2):129-138.

[8]Fournier E,Passirani C,Montero-Menei CN,et al.Biocompatibility of implantable synthetic polymeric drug carriers:focus on brain biocompatibility[J].Biomaterials,2003,24(19):3311-3331.

[9]Zhang W,Zeng YS,Zhang XB,et al.Combination of adenoviral vector-mediated neurotrophin-3 gene transfer and retinoic acid promotes adult bone marrow cells to differentiate into neuronal phenotypes[J].Neurosci Lett,2006,408(2):98-103.

[10]Himes BT,Neuhuber B,Coleman C,et al.Recovery of function following grafting of human bone marrow-derived stromal cells into the injured spinalcord[J].Neurorehabil Neural Repair,2006, 20(2):278-296.

[11]Zhang N,Yan H,Wen X,et al.Tissue-engineering approaches for axonal guidance[J].Brain res rev,2005,49(1):48-64.

[12]Thomson RC,Yaszemski MJ,Powers JM,et al.Hydroxyapatite fiber reinforced poly(alpha-hydroxy ester)foams for bone regeneration[J].Biomaterials,1998,19(21):1935-1943.

[13]Guarino V,Causa F,Taddei P.Polylactic acid fibre-reinforced polycaprolactone scaffolds for bone tissue engineering[J]. Biomaterials,2008,29(27):3662-3670.

[14]Matsumoto M,Chosa E,Nabeshima K,etal.Influence ofbioresorbable, unsintered hydroxyapatite/poly-L-lactide composite films on spinal cord,nerve roots,and epidural space[J].J Biomed Mater Res, 2002,60(1):101-109.

[15]Li J,Shi R.Fabrication of patterned multi-walled poly-l-lactic acid conduits for nerve regeneration[J].J NeurosciMethods,2007, 165(2):257-264.

[16]Hurtado A,Moon LD,Maquet V,et al.Poly(D,L-lactic acid) macroporous guidance scaffolds seeded with Schwann cells genetically modified to secrete a bi-functional neurotrophin implanted in the completely transected adult rat thoracic spinal cord[J].Biomaterials,2006,27(3):430-442.

[17]Ma PX,Zhang R.Synthetic nano-scale fibrous extracellular matrix [J].J Biomed Mater Res,1999,46(1):60-72.

[18]Yang F,Murugan R,Ramakrishna S,et al.Fabrication of nanostructured porous PLLA scaffold intended for nerve tissue engineering[J].Biomaterials,2004,25(10):1891-1900.

[19]Woo KM,Chen VJ,Ma PX.Nano-fibrous scaffolding architecture selectively enhances protein adsorption contributing to cell attachment[J].J Biomed Mater Res A,2003,67(2):531-537.

[20]Woo KM,Jun JH,Chen VJ.Nano-fibrous scaffolding promotes osteoblast differentiation and biomineralization[J].Biomaterials, 2007,28(2):335-343.

[21]Zhang R,Ma PX.Synthetic nano-fibrillar extracellular matrices with predesigned acroporous architectures[J].J Biomed Mater Res,2000,52(2):430-438.

Research Biocompatibility of the Poly(l-lactic acid)Nano-fibrous Scaffolds with Spinal Cord Tissues in Rats

ZHANG Yanqing1,ZENG Yuanshan1,HE Liumin2,QUAN Daping2,LI Yan1.
1 Division of Neuroscience,Department of Histology and Embryology,Zhongshan School of Medicine,Sun Yat-sen University,Guangzhou 510080,China；2 Institute of Polymer Science,School of Chemistry and Chemical Engineering,Sun Yat-sen University,Guangzhou 510275,China. Corresponding author:ZENG Yuanshan.

ObjectiveTo explore the biocompatibility of the Poly(l-lactic acid)(PLLA)nano-fibrous scaffold with spinal cord tissue of rats.MethodsPLLA three-dimensional(3D)scaffolds with macro/micro-pores and nano-fibrous structure were fabricated by phase separation from a ternary PLLA/dioxane/water system.MSCs-PLLA nano-fibrous scaffolds complex were constructed in vitro.Twelve SD rats were divided into two groups:control injured group and MSCs transplanted group. T10 spinal cord segment was exposed,and then transected.About 2 mm spinal cord was removed.PLLA nano-fibrous scaffolds were transplanted into the transected site of spinal cord in the control injured group.MSCs-PLLA complex were transplanted into the injured site in the MSCs transplanted group.Sixty days after operation,the histological observations and immunohistochemistry were carried out.ResultsPLLA nano-fibrous scaffolds interconnected micropores were composed. The well-distributed MSCs in MSCs-PLLA nano-fibrous scaffold complex can be observed under the scanning electron microscope and fluorescence microscope.Sixty days after transplantion,there were no scars and big cavitates between spinal cord and PLLA nano-fibrous scaffold.There was no obvious inflammatory response under the CD68 immunohistochemistry staining between the host spinal cord and transplantion.Sixty days after transplantation,there were large amount of MSCs in the PLLA nano-fibrous scaffold under GFP immunohistochemistry staining.ConclusionThe PLLA nano-fibrous scaffolds is a good matrix,which has good biocompatibility rat spinal cord tissue in rats.

PLLA;Nano-fibrous scaffold;Bone marrow mesenchymal stem cells;Spinal cord injury; Biocompatibility

R318.08，R392.45

A

1673－0364（2009）03－0143－05

2009年4月12日；

2009年6月3日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.06.007

國家自然科學基金(30771143)；廣東省自然科學基金(07117373)。

510080廣東省廣州市中山大學中山醫(yī)學院組織胚胎學教研室神經(jīng)科學研究室(張燕青，曾園山，李燕)；510275廣東省廣州市中山大學化學與化學工程學院高分子研究所(何留民，全大萍)。

曾園山。