賴英榮　朱慶棠　劉小林

【摘要】 目的 研究人類外周神經(jīng)在化學(xué)萃取前后的組織形態(tài)變化，探討化學(xué)萃取法制備人類長段粗大去細(xì)胞神經(jīng)的可行性。方法 用Triton X-100和脫氧膽酸鈉對人體長段脛神經(jīng)作不同次數(shù)的萃取處理，經(jīng)常規(guī)HE染色、砂羅鉻花青、網(wǎng)狀纖維組織化學(xué)染色和S-100免疫組織化學(xué)染色后，在光鏡下觀察神經(jīng)萃取前后的組織形態(tài)變化，并比較不同萃取次數(shù)對神經(jīng)結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果 人體長段脛神經(jīng)經(jīng)2次萃取后，其軸突、髓鞘、許旺細(xì)胞及其他結(jié)締組織中的細(xì)胞均已消失，僅見網(wǎng)格纖維，而神經(jīng)基底膜管、神經(jīng)束膜等纖維性支架保存完整，與未經(jīng)萃取的神經(jīng)相仿。萃取1次者仍殘留少量細(xì)胞碎屑，而萃取3次者，細(xì)胞清除更徹底，但纖維性支架結(jié)構(gòu)明顯破壞。結(jié)論 人類長段粗大神經(jīng)干經(jīng)化學(xué)萃取后不含細(xì)胞，而保留有完整的纖維性支架結(jié)構(gòu)?；瘜W(xué)萃取法制備人類長段粗大去細(xì)胞神經(jīng)可行。

【關(guān)鍵詞】 外周神經(jīng);人類;化學(xué)萃取;組織形態(tài)

Study on the histomorphology of human peripheral nerve treated with chemical extraction

LAI Ying-rong, ZHU Qing-tang,LIU Xiao-lin.

Department of Pathology Ist Hospital,Sun Yat-sen University,Guangzhou 510080 China

【Abstract】 Objective To investigate the histomorphology of human peripheral nerve treated with chemical extraction, and assess the feasibility of preparing human acellular nerve graft through chemical extraction. Methods Long segments of human tibia nerve were treated with Triton X-100 and sodium deoxycholate for different times. The nerves were sectioned, stained with HE, myelin (Page), reticular fiber (Gordon-Sweet), and S-100, and then examined under light microscope. The histomorphology of the nerve extracted for different times were compared.Results Extracted for 2 times, the axons, myelin, Schwann Cells and other cells in the connective tissue disappeared, while the reticular fiber, neural basal membrane tubes and perineuriums were preserved. The fiber framework of the extracted nerve was similar to that of the nerve prior to extraction. Cell debris was found in the nerve extracted for 1 time. When the nerve was extracted for 3 times, cells were removed completely. However, the fiber framework was destroyed. Conclusions Extracted with chemical agents, the cells in the long and thick human peripheral nerve are removed, while the fiber framework can be preserved. Human acelluar nerve can be made through chemical extraction.

【Key words】 Peripheral nerve;Human;Chemical extraction;Histomorphology

近年來隨著人工材料在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，人們不斷嘗試用人工合成的材料或生物材料制成神經(jīng)導(dǎo)管，作為神經(jīng)的再生通道，但受到材料加工技術(shù)的限制，至今仍未能制成具有周圍神經(jīng)復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)支架。自Dumont等^［1］和 Sondell等^［2］報(bào)道用化學(xué)萃取法可去除大鼠坐骨神經(jīng)中的細(xì)胞而保留神經(jīng)基底膜管以來，人們還用類似方法制備了兔、犬和猴的去細(xì)胞神經(jīng)^［3-5］。這種方法既除去了神經(jīng)中的抗原成份，降低神經(jīng)免疫原性的同時(shí)又保留了神經(jīng)復(fù)雜的三維支架結(jié)構(gòu)，為制備仿生化的人工神經(jīng)支架材料開辟了新途徑^［6,7］。本文參照Sondell等的方法處理人類長段粗大的外周神經(jīng)，通過觀察其大體及組織形態(tài)學(xué)上改變，探討該方法能否制備長段粗大的去細(xì)胞神經(jīng)支架，為以后制備具有人類神經(jīng)天然結(jié)構(gòu)的仿生化神經(jīng)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 人體周圍神經(jīng)的來源與萃取

人體神經(jīng)取自一大腿創(chuàng)傷性截肢患者捐獻(xiàn)的廢棄肢體，切取其脛神經(jīng)，自股骨髁至內(nèi)踝全長40 cm。將神經(jīng)截成4段，每段10 cm，直徑為6 mm，取其中3段神經(jīng)按下列步驟進(jìn)行萃取，余下的新鮮神經(jīng)作對照。①在10倍手術(shù)顯微鏡下剪去神經(jīng)周圍的脂肪和部分神經(jīng)外膜，保留神經(jīng)束以及連接神經(jīng)束的部分外膜;②用1000 ml蒸餾水泡6 h，每2 h換液1次;③放入300 ml 3%TritonX-100溶液中，室溫下靜置12 h;④在1000 ml蒸餾水中震蕩、漂洗3遍，10 min/次;⑤放入4%脫氧膽酸鈉溶液中，室溫下震蕩24 h;⑥在1000 ml蒸餾水中震蕩、漂洗3遍， 10 min/次。每次萃取均重復(fù)步驟③~⑥，3段神經(jīng)分別萃取1、2、3次。

1.2 標(biāo)本的處理

神經(jīng)萃取后于其中段切取1 cm長的組織，另取1 cm長的新鮮脛神經(jīng)作對照。標(biāo)本用10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋、切片，分別進(jìn)行HE染色、組織化學(xué)染色砂羅鉻花青染色和網(wǎng)狀纖維染色以及S-100免疫組織化學(xué)染色。光鏡下觀察神經(jīng)萃取前后其組織形態(tài)的變化。

2 結(jié)果

2.1 大體上觀察 新鮮神經(jīng)外觀完整，豐滿堅(jiān)韌富有彈性，萃取后的神經(jīng)疏松，乳白色，質(zhì)地柔軟。

2.2 光學(xué)顯微鏡下觀察 ①HE染色，未經(jīng)萃取的神經(jīng)可見神經(jīng)軸突、許旺細(xì)胞、束膜細(xì)胞、成纖維細(xì)胞，以及散在分布的細(xì)胞，經(jīng)1次萃取后仍隱約見個(gè)別許旺細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞，縱橫切面神經(jīng)結(jié)構(gòu)完整，清楚。經(jīng)2次萃取后，神經(jīng)內(nèi)見不到細(xì)胞，藍(lán)染的細(xì)胞核消失，神經(jīng)內(nèi)僅見網(wǎng)格纖維，縱橫切面神經(jīng)結(jié)構(gòu)基本完整。經(jīng)3次萃取后，神經(jīng)內(nèi)所有細(xì)胞消失，橫切面見神經(jīng)皺縮，結(jié)構(gòu)破壞，縱切面見神經(jīng)束散亂；②砂羅鉻花青染色，未經(jīng)萃取的神經(jīng)，神經(jīng)髓鞘被染成鮮藍(lán)色，紅細(xì)胞深藍(lán)色，膠原纖維鮮紅色，細(xì)胞核和核仁藍(lán)色，經(jīng)萃取1次、2次、3次后的神經(jīng)砂羅鉻花青染色均為陰性；③網(wǎng)狀纖維染色，未經(jīng)萃取神經(jīng)，可見網(wǎng)格纖維及細(xì)胞核，而萃取后的神經(jīng)只見網(wǎng)格纖維，細(xì)胞核則未見顯示；④S-100染色，未萃取神經(jīng)呈陽性，經(jīng)1次萃取后的神經(jīng)，橫切面見神經(jīng)內(nèi)出現(xiàn)少量棕色的陽性反應(yīng)信號，經(jīng)2次萃取后的神經(jīng)內(nèi)基本看不到陽性反應(yīng)信號，經(jīng)3次萃取后神經(jīng)內(nèi)檢測不到陽性反應(yīng)信號。

3 討論

近年來，隨著人工材料或生物材料在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，人們不斷嘗試用人工合成的材料或生物材料制成神經(jīng)導(dǎo)管，作為神經(jīng)再生的臨時(shí)通道。周圍神經(jīng)損傷后,再生軸突在物理性通道的引導(dǎo)下通過神經(jīng)缺損區(qū)，同時(shí)需要許旺細(xì)胞分泌多種因子促進(jìn)其再生。自體神經(jīng)有完整的神經(jīng)基底膜管作為再生通道，是修復(fù)神經(jīng)缺損的理想材料，但自體神經(jīng)來源有限，且會產(chǎn)生新的神經(jīng)損傷。異體或異種神經(jīng)雖有完整的神經(jīng)基底膜管，但異體(種)神經(jīng)移植往往會因排斥反應(yīng)而失敗。外周神經(jīng)主要含有構(gòu)成神經(jīng)纖維的軸突、髓鞘和許旺細(xì)胞，構(gòu)成血管的細(xì)胞以及神經(jīng)束的神經(jīng)束膜細(xì)胞和外膜細(xì)胞，這些細(xì)胞具有強(qiáng)免疫原性，是引起異體（種）神經(jīng)移植排斥反應(yīng)的主要物質(zhì)。Dumont等和Sondell等先后報(bào)告了用不同的化學(xué)藥物清除大鼠周圍神經(jīng)中的細(xì)胞、髓鞘及其崩解碎片的方法^［1,2］?；瘜W(xué)萃取法制備大鼠10 mm長的去細(xì)胞坐骨神經(jīng)獲得成功，神經(jīng)萃取后僅剩下神經(jīng)基底膜管和神經(jīng)結(jié)締組織中膠原成份，其免疫原性大為降低。但此方法能否去除長段、粗大的人類外周神經(jīng)中的細(xì)胞，仍有待摸索。本實(shí)驗(yàn)參照Sondell等方法來萃取10 cm長、直徑為6 mm的脛神經(jīng)，詳細(xì)研究了不同萃取次數(shù)后神經(jīng)在大體、常規(guī)HE、組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)檢測所見的形態(tài)變化。萃取1次神經(jīng)內(nèi)殘留少量細(xì)胞碎屑，萃取2次仍有極少量S-100殘留而基底膜管和神經(jīng)束膜等纖維性支架完整，萃取3次，破壞神經(jīng)支架結(jié)構(gòu)。萃取后的神經(jīng)束內(nèi)所有的細(xì)胞包括許旺細(xì)胞、束膜細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管的內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞均已消失，神經(jīng)髓鞘和軸突被清除。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示萃取神經(jīng)的組織形態(tài)及組織抗原與萃取次數(shù)有密切關(guān)系，萃取2次較為理想。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)還證明了用化學(xué)萃取法清除人類外周神經(jīng)中的細(xì)胞而保存纖維性支架是可行，采用該方法可制備長段粗大的人類去細(xì)胞神經(jīng)。

參考文獻(xiàn)

［1］ Dumont CE , Hentz VR .Enhancement of axon growth by detengent-extracted nerve grafts .Transplantation ,1997 ,63:1210-1215.

［2］ Sondell M , Lundborg G ,Kanje M .Regeneration of the rat sciatic nerve into allografts made acellular through chemical extraction .Brain Res ,1998,795:44-54.

［3］ 李躍軍, 陳紹宗, 李學(xué)擁, 等.去細(xì)胞異體神經(jīng)材料復(fù)合堿性成纖維細(xì)胞生長因子修復(fù)周圍神經(jīng)缺損.中華創(chuàng)傷雜志,2003,19(8):491-493.

［4］ 衷鴻賓,侯樹勛,陳秉耀.犬化學(xué)去細(xì)胞神經(jīng)同種異體移植的實(shí)驗(yàn)研究.中華創(chuàng)傷骨科雜志,2004,6(4):418-422.

［5］ 衷鴻賓,侯樹勛,陳秉耀.靈長類去細(xì)胞神經(jīng)的萃取制備及異體移植后早期神經(jīng)再生觀察.中華創(chuàng)傷骨科雜志,2004,6(6):657-660

［6］ 孫明學(xué),唐金樹,王鑫,等.去細(xì)胞處理對化學(xué)去細(xì)胞異體神經(jīng)免疫原性的影響.中華外科雜志,2006,44(4):275-278.

［7］ 許揚(yáng)濱,胡軍,江長青,等.用去細(xì)胞同種異體神經(jīng)構(gòu)建獼猴組織工程化神經(jīng)的實(shí)驗(yàn)研究.中華顯微外科雜志,2005,28:136-138.