孫海燕　王利沙

摘要 利用聚丙烯酰胺凝膠電泳法對8個大白菜品種的過氧化物酶（POD）同工酶進行分析。結果表明，8個品種的POD同工酶酶譜在酶帶數(shù)、遷移率、酶量（酶帶寬窄）及酶活性（酶帶深淺）等方面均存在相似性，但也有一定的差異。依酶譜帶特征初步將8個品種進行分類，并對其親緣關系進行了分析。

關鍵詞 大白菜；過氧化物酶同工酶；譜帶；親緣關系

中圖分類號 S634.1 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2009）05-0008-02

同工酶廣泛存在于生物界中，它表現(xiàn)出明顯的種屬、組織和發(fā)育階段的特異性，既是生理指標，又是可靠的遺傳標志[1]。過氧化物酶同工酶在高等植物中廣泛而大量地存在，具有高度多型性、器官組織特異性和相對穩(wěn)定性，即同一器官的同一發(fā)育時期，POD同工酶酶譜和活性強弱是穩(wěn)定的，能反映植物的遺傳特性[2]。因而同工酶分析技術被廣泛地運用于植物的分類鑒定、親緣關系及矮化砧木的預選、抗寒性和抗病性鑒定等研究領域。筆者采用聚丙烯酰胺凝膠電泳方法，對濰坊地區(qū)普遍栽種的8個品種的大白菜過氧化物酶同工酶進行分析研究，以期在測定同工酶譜帶的基礎上，探討以同工酶譜帶特征作為大白菜品種鑒定的依據(jù)，進一步測定大白菜品種間的親緣關系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料購于濰坊市農(nóng)科院蔬菜研究所，共8個品種，分別為：濰白秋冠、濰白-78、濰白-68、濰白ER-60、濰白-45、濰白四號、濰白二號及濰白一號。

1.2 試驗方法

1.2.1 酶液提取。取8個品種大白菜的種子放入培養(yǎng)皿中，加水在培養(yǎng)箱中（15～25℃）黑暗條件下培養(yǎng)4d。分別取葉片（除去葉脈）0.5g，洗凈用濾紙吸干水分，剪碎置于預冷的研缽中，加入酶提取液（由蔗糖10mL、電極緩沖液2mL、無離子水8mL組成）1mL，研磨成勻漿，移入離心管中，8 000rpm離心10min，取上清液備用。

1.2.2 電泳。聚丙烯酰胺凝膠電泳參照張衛(wèi)國（2006）等的方法[2-6]，略有改進。染色參照楊太興（1991）、孟秋峰（2006）方法[7，8]，采用醋酸—聯(lián)苯胺法，略有改進。染色液的成分為：聯(lián)苯胺0.5g，冰醋酸3.75mL，4%氯化銨溶液1g，30%雙氧水350μL，5%EDTA 25mL，加蒸餾水混合定容至100mL。

1.2.3 照相及繪制酶譜模式圖。電泳照片拍照，并根據(jù)各酶帶的相對遷移率繪制過氧化物酶同工酶酶譜模式圖。酶帶的相對遷移率Rf = 酶帶的遷移距離/溴酚藍的遷移距離[9]。

2 結果與分析

2.1 不同品種大白菜過氧化物酶同工酶酶譜特征

大白菜葉片過氧化物同工酶經(jīng)電泳后，顯示的酶譜帶3~5條不等（見圖1），從酶譜表型可以看出，同類品種的酶譜具有較穩(wěn)定的相似性。把它們分成A、B、C等3個區(qū)，其中A區(qū)有1~2條酶帶，染色較深；B區(qū)染色淺，酶帶數(shù)1~2條不等；C區(qū)染色最深，活性最高，有1條酶帶。酶帶的染色深淺在一定程度上表示了酶活性的強弱不同。濰白ER-60酶帶的活性普遍低于其他品種。

2.2 遷移距離

溴酚藍（即前沿指示劑）的遷移距離為7.1cm；8個大白菜品種的過氧化物酶同工酶譜帶的遷移距離見表1。各個品種的酶帶數(shù)差別較大，但部分酶帶的排列具有一定的規(guī)律性。另外，從表1可以看出，在大白菜譜帶的B區(qū)有一條特征性譜帶，遷移距離是4.45cm。

2.3 過氧化物酶同工酶的相對遷移率

8種大白菜共產(chǎn)生32條酶帶，表現(xiàn)出13種不同的遷移率，Rf值變動在 0.17~0.88之間，但酶帶出現(xiàn)的頻率差異不是很大。酶帶的遷移距離與酶帶數(shù)見表2所示。綜合8個品種的酶帶遷移率可以得出，Rf =0.63位置的酶帶可以說是幾個白菜品種的基本譜帶，為8個品種所共有。酶譜模式見圖2。

2.4 過氧化物酶同工酶酶譜間相似系數(shù)

相似系數(shù)采用以下公式計算：C＝2W/（a+b）[5，9]；其中：C為酶譜間相似系數(shù)；W為A和B 2個品種相同的酶帶數(shù)；a為品種A在酶譜中的酶帶數(shù)；b為品種B在酶譜中的酶帶數(shù)。不同品種大白菜的酶譜間的相似系數(shù)見表3。

從表3中可以分析出，相似系數(shù)越大，說明品種間的親源關系越近。相反，相似系數(shù)越小，品種間的親源關系就越遠。相似系數(shù)最大的是濰白一號與濰白二號、濰白四號與濰白-45、濰白二號與濰白-68，相似系數(shù)都為0.75；其次為濰白秋冠與濰白-78，相似系數(shù)為0.66；濰白ER-60與濰白-45、濰白ER-60與濰白四號相似系數(shù)都為0.57；濰白-68與濰白-78、濰白二號與濰白-78、濰白一號與濰白-78、濰白-68與濰白一號、濰白-45與濰白一號、濰白-45與濰白二號相似系數(shù)都為0.50；其余品種之間的相似系數(shù)較小。

3 結論與討論

過氧化物酶同工酶分析法不僅能較為客觀地反映物種間的遺傳差異和它們的親緣關系，而且利用其進行物種的輔助鑒定，是一種較為方便、有效的手段[10]。過氧化物酶同工酶在大白菜中廣泛而大量地存在，具有高度多型性、器官組織特異性和相對穩(wěn)定性。即同一器官的同一發(fā)育時期，POD同工酶酶譜和活性強弱是穩(wěn)定的，能反映大白菜的遺傳特性[11，12]。要想研究過氧化物酶與不同品種的系譜進化及抗逆性之間的關系，應選具有代表性、一致性的品種，最好是地方品種。因為品種在遷移過程中可能會出現(xiàn)變異或環(huán)境的不適應，同時過氧化物酶受氣候環(huán)境、溫度、生長發(fā)育時期等方面的影響也很大[13]。作為基因的表達產(chǎn)物，酶具有一定的不穩(wěn)定性，在很多情況下要受到環(huán)境條件的影響，而且許多因素也會影響電泳及分析效果，這都使得試驗存在一定的誤差。

本試驗的8個大白菜品種是濰坊地區(qū)普遍栽植的品種，經(jīng)分析在酶帶數(shù)量、位點及分布格局上有一定的相似性，在酶帶的共性方面也表現(xiàn)出一定的相似性，即品種與品種之間、幾個品種之間出現(xiàn)相同的1~3條同帶。這說明他們在種間有一定的相似性，8種植物間存在著親緣關系。這種親緣關系還需要通過進行種間相似性聚類分析進一步得出結論。

4 參考文獻

[1] 閆忠業(yè)，伊凱，李作軒，等.富士系蘋果過氧化物酶同工酶研究[J].沈陽農(nóng)業(yè)大學學報，2006（4）：578-581.

[2] 劉永軍，王同坤，齊永順，等.不同板栗品種（系）過氧化物酶同工酶的分析比較（簡報）[J].河北科技師范學院學報，2006（4）：72-75，80.

[3] 陳學群，周光凡，周源，等.芥菜脂酶同工酶分析[J].西南農(nóng)業(yè)學報，1993，6（3）：40-46.

[4] 劉永軍，郭守華，楊曉玲.植物生理生化實驗[M].北京：中國農(nóng)業(yè)科技出版社，2002.

[5] 張衛(wèi)國，羅冬梅，徐穎利，等.10個品種向日葵過氧化物酶同工酶分析[J].內蒙古民族大學學報（自然科學版），2006，21（5）：528-531.

[6] 吳沿友，周光藝.蕓薹族幾種近緣植物的過氧化物同工酶的研究[J].貴州農(nóng)業(yè)科學，1996（2）：14-17.

[7] 孟秋峰，王毓洪，頓蘭鳳，等.八個芥菜品種的過氧化物同工酶分析[J].安徽農(nóng)學通報，2006，12（11）：70-71.

[8] 楊太興，賈希海，李仁風，等.同工酶電泳技術在品種純度檢驗中的應用研究[J].種子，1991（6）：1-5.

[9] 陳學群，周光凡.芥菜脂酶同工酶分析[J].西南農(nóng)業(yè)學報，1993，6（3）：40-46.

[10] 謝可軍，李陽春，吳天德.10種早熟禾屬植物的過氧化酶同工酶分析[J].中國草地，2003，25（2）：30-33.

[11] 吳少伯.植物組織中蛋白質及同工酶的聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳[J].植物生理學通訊，1979（1）：30-33.

[12] 卞阿娜，方份.菊花7個品種過氧化物酶同工酶分析[J].漳州師范學院學報，2003，16（1）：78-81.

[13] 郭水良，毛郁薷.溫度對過氧化物酶同工酶譜的影響[J].廣西植物，2002，22（6）：557-562.