王　燕　鐘世軍　邵　敏　張青峰

【摘要】目的：為了研究乳腺癌發(fā)生的分子遺傳學(xué)機(jī)理，分離克隆模型鼠乳腺癌組織中特異表達(dá)的基因。方法：利用抑制消減雜交技術(shù)，結(jié)合反向cDNA斑點(diǎn)雜交試驗(yàn)，小鼠乳腺癌組織中分離出與正常乳腺組織差異表達(dá)的EST，應(yīng)用生物信息學(xué)方法鑒定所得EST的小鼠同源基因，并分析其與乳腺癌發(fā)生的相關(guān)性。結(jié)果：獲得20個(gè)在小鼠乳腺癌組織中高表達(dá)的，與已知的小鼠基因片段高度同源的基因，及2個(gè)與數(shù)據(jù)庫(kù)中提交的假想蛋白基因高度同源的基因。結(jié)論：利用抑制消減雜交技術(shù)，可以高效高通量分析在乳腺癌中特異表達(dá)的基因，探討乳腺癌發(fā)生的分子機(jī)制。

【關(guān)鍵詞】抑制消減雜交技術(shù)；乳腺癌；基因

【中圖分類號(hào)】R737.9【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A【文章編號(hào)】1007-8517(2009)10-0021-02

Screening Specific Expressed Genes of Breast Cancer by SSH

WANG YanZGHONGShijunSHAO MinZHANG Qingfeng

(ZUNYi Medical College School of Zhu Hai ,GUANG Dong,Zhu Hai ,519041）

【Abstract】 Objective In order to study the molecular mechanism of breast cancer, to screen the genes differentially expressed in breast cancer. Methods Suppression subtractive hybridization (SSH)combine reverse dot blotting was performed to isolate the differentially expressed genes between breast cancer and normal mammarytissues. A subtractive cDNA library of highly expressed genes in breast tumor tissue was established. Result About 22 differentiallyexpressed genes were obtained. By sequencing and BLAST analysiswe found 2 genes are new genes. Conclusion SSHis an effective method with high specificity to detect specific expressed genes in breastcancer genesisanddevelopment.

【Keywords】SSH；breast cancer；gene

乳腺癌是一種女性多發(fā)的惡性腫瘤。我國(guó)原屬乳腺癌低發(fā)區(qū)，但近年來也出現(xiàn)明顯上升趨勢(shì)。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,對(duì)癌基因和抑癌基因研究的深入,他們已經(jīng)成為新一代的腫瘤標(biāo)志物^[1,2]。本文以抑制消減雜交技術(shù)（SSH），結(jié)合反向cDNA斑點(diǎn)雜交試驗(yàn)，從乳腺癌轉(zhuǎn)基因模型小鼠乳腺癌組織和正常乳腺組織中篩選乳腺癌組織高表達(dá)基因^[3]。以期發(fā)現(xiàn)與乳腺癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)基因和診斷標(biāo)志物，為乳腺癌的防治研究奠定基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1材料FVB/N-Tg (MMTVneu)202Mul/J轉(zhuǎn)基因小鼠，購(gòu)于美國(guó)The Jackson Laboratory。

1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑PolyA Ttract mRNA Isolation Systems Kit購(gòu)自Promega公司；PCR-Select cDNA Subtraction Kit購(gòu)自Clontech公司；DIG-11-dUTP購(gòu)于Roche公司。

1.3方法

1.3.1抑制消減雜交按PCR-Select cDNA Subtraction Kit說明書，以轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺癌組織作為檢測(cè)子（tester），正常乳腺組織作為驅(qū)趕子（driver），各以2μgmRNA為模板，合成雙鏈cDNA，經(jīng)Rsa I酶消化，接頭連接兩輪雜交，兩輪PCR，純化第二輪PCR產(chǎn)物，得到消減產(chǎn)物。每一步都經(jīng)過試驗(yàn)驗(yàn)證效率。

1.3.2反向cDNA斑點(diǎn)雜交純化上述PCR產(chǎn)物，經(jīng)NaOH變性后分兩個(gè)陣列平行點(diǎn)樣于兩張尼龍膜上，每個(gè)點(diǎn)面積為0.5cm×0.5cm，點(diǎn)加濃縮的PCR產(chǎn)物約200ng (1μL)。經(jīng)紫外交聯(lián)固定。用DIG-11-dUTP標(biāo)記探針，探針為tester和driver的cDNA。經(jīng)過預(yù)雜交、封閉、洗膜等步驟，分別和兩種探針共孵育，再進(jìn)行洗膜、封閉、洗膜，經(jīng)DAB暗室顯色至滿意程度。

1.3.3測(cè)序及同源性分析挑取經(jīng)驗(yàn)證的陽(yáng)性克隆，送Invitrogen公司測(cè)序，利用BLAST軟件分析。

2結(jié)果

2.1總RNA的提取提取總RNA，其D260/D280均大于1.9，瓊脂糖電泳可見清晰28s、18s條帶（圖1）。

2.2消減效率檢驗(yàn)未消減對(duì)照中的看家基因G3PDH經(jīng)18個(gè)循環(huán)擴(kuò)增幾出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，而消減后在28個(gè)循環(huán)后擴(kuò)增條帶剛剛可見（圖1），顯示經(jīng)過消減雜交及抑制性PCR，豐度相同的基因得到有效抑制。

2.3PCR檢測(cè)陽(yáng)性克隆消減產(chǎn)物經(jīng)T/A克隆，藍(lán)白斑實(shí)驗(yàn)隨機(jī)篩選了258個(gè)陽(yáng)性克隆，用巢氏PCR的內(nèi)因物進(jìn)行PCR檢測(cè)，剔除無產(chǎn)物的克隆，選取擴(kuò)增片段在200-1000bp之間，冗余性盡可能低的240個(gè)克隆進(jìn)行進(jìn)一步分析。部分PCR檢測(cè)結(jié)果如下圖（圖2）。

2.4反向cDNA斑點(diǎn)雜交結(jié)果陽(yáng)性克隆的PCR產(chǎn)物平行點(diǎn)在尼龍膜上，分別與地高辛標(biāo)記的tester和driver cDNA探針進(jìn)行雜交，結(jié)果提示多個(gè)克隆存在雜交信號(hào)的差異（圖3）。

2.5序列測(cè)定和同源性分析挑取50個(gè)差異顯示的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒送去測(cè)序，用BLAST軟件分析，在50個(gè)獲得EST中，有27個(gè)分別與16個(gè)已知基因高度同源，2個(gè)EST與假想基因同源。篩選出的已知基因見表1。

3討論

基因組中基因的選擇性表達(dá)決定了生物體的各項(xiàng)生命活動(dòng)。因此，了解疾病病理過程不同階段基因表達(dá)差異，疾病過程與正常發(fā)育過程的基因表達(dá)差異，對(duì)于疾病的診斷與治療具有重要意義。隨著分離組織特異性基因的研究方法不斷發(fā)展，人們對(duì)各種疾病的研究逐漸深入到分子水平。抑制消減雜交是Diatchenk等^[4]提出的較代表性差異分析法更簡(jiǎn)便而有效地尋找差異表達(dá)基因的方法，它是以抑制PCR為基礎(chǔ)的cDNA消減雜交方法，它的特點(diǎn)是假陽(yáng)性低、敏感性高，對(duì)于低豐度的差異表達(dá)基因也能有效的分離。本研究應(yīng)用抑制消減雜交技術(shù)結(jié)合反向cDNA斑點(diǎn)雜交試驗(yàn)，獲得的28個(gè)EST中，有27個(gè)與16個(gè)已知基因高度同源，從表1可以看出，在這些基因中，casein kappa (Csnk)是乳腺組織分化的標(biāo)記物^[5]；casein gamma (Csng)能夠被催乳素誘導(dǎo)，transferrin (Trf)有多篇文獻(xiàn)報(bào)道其在乳腺癌等惡性腫瘤中表達(dá)增高、member RAS oncogene family (Rab25)屬于RAS原癌基因家族，這些結(jié)果提示乳腺癌的發(fā)病與發(fā)展過程中涉及多個(gè)基因的差異表達(dá)。此外，在我們獲得EST中還有一個(gè)假想基因，功能不明，在后面的工作中我將對(duì)這個(gè)EST進(jìn)行重點(diǎn)研究。本文首次以小鼠乳腺癌組織為研究對(duì)象，篩選出一系列在乳腺癌中特異表達(dá)的基因，作為一種重要的資源，將給以后的研究工作帶來很大的方便，為進(jìn)一步研究乳腺癌新的生物標(biāo)志物及其治療靶點(diǎn)奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1]吳曉江，陳克能，徐光煒.乳腺癌新的生物標(biāo)志物及其治療靶點(diǎn)—HER2及trastuzumab的研究進(jìn)展[J].中國(guó)癌癥雜志,2002, 12(2)

[2]Pinkas-Kramarski R, Eilam R, Alroy I, er al. Differential expression of NDF/neuregulin receptors ErbB-3 and ErbB-4 and involvement in inhibition of neuronal differentiation[J]. Oncogene, 1997, 15 (23): 2803-2805

[3]周津，劉芝華，王秀琴,等.抑制消減雜交及反Northern結(jié)合高通量篩選食管癌中差異表達(dá)基因[J].科學(xué)通報(bào),2002,46(3)

[4]Diatchenko L, Lau YF, Campbe11 AP, et al. Suppression subtractive hybridization: a methodor generating differentially regulated or tissue-specific cDNA probes and libraries[J].. Proc Natl Acad Sci U S A,1996, 93 (12): 6025-6030

[5]Earl HM, McIlhinney RA, Wilson P, Gusterson BA, Coombes RC. Immunohistochemical study of beta- and kappa-casein in the human breast and breast carcinomas, using monoclonal antibodies. Cancer Res. 1989 Nov 1;49(21):6070-6

(收稿日期：2009.04.05)