江 珊 韓 豪 江 海 田 姍

摘要建立分析測(cè)定苦豆和狼牙刺種子中苦參堿與氧化苦參堿含量的高效液相色譜法,并對(duì)其含量進(jìn)行測(cè)定、分析、比較。結(jié)果表明:該色譜法能用于苦豆和狼牙刺種子中苦參堿和氧化苦參堿含量檢測(cè),并測(cè)得其含量在苦豆和狼牙刺種子中各有優(yōu)勢(shì);狼牙刺種子在氧化苦參堿制備方面有利用價(jià)值。

關(guān)鍵詞苦豆;狼牙刺種子;苦參堿;氧化苦參堿;含量

中圖分類號(hào)R284.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào) 1007-5739(2009)11-0017-02

苦豆(Sophoraalopecuroides L. )為豆科植物苦參的種子,又名苦參實(shí)、苦參子。廣泛分布于我國(guó)青海、甘肅、陜西、寧夏、內(nèi)蒙古等省區(qū)。主要含有苦參堿、氧化苦參堿,具有清熱燥濕、殺蟲(chóng)、利尿等功效[1-2]。

狼牙刺(Sophora viciifolia H.)為豆科槐屬多年生灌木,又名白刺花,廣泛分布于我國(guó)的河北、山西、陜西、甘肅、河南、四川、云南、貴州等省區(qū)。狼牙刺作為一種秦巴地區(qū)廣泛使用的民間藥材,已有悠久的歷史。據(jù)檢測(cè)分析,其種子中含有苦參堿(Matrine)、氧化苦參堿(Oxymatrine)等多種生物堿[3-5]。

現(xiàn)代藥理研究表明,以苦參堿、氧化苦參堿為代表的苦參類生物堿具有抗炎、保肝、抗腫瘤、抗心律失常、免疫調(diào)節(jié)和升高白細(xì)胞等作用[6-11]。漢中為苦豆和狼牙刺的適宜生長(zhǎng)區(qū)之一,野生資源十分豐富。本文采用高效液相色譜法,對(duì)漢中野生苦豆和狼牙刺種子中的苦參堿、氧化苦參堿含量進(jìn)行了測(cè)定、分析,旨在建立一種分析測(cè)定苦豆和狼牙刺中苦參堿與氧化苦參堿的高效液相色譜法,并探討苦參堿與氧化苦參堿含量的差異,為合理開(kāi)發(fā)利用苦豆和狼牙刺種子資源提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試材料

苦豆和狼牙刺種子均采自陜西省漢中市西鄉(xiāng)縣桑園鎮(zhèn),于105℃烘箱內(nèi)烘干、粉碎,過(guò)40目分樣篩,備用。

1.2儀器

液相色譜儀(Agilent 1100,安捷倫公司);超聲波清洗儀(SK-120E,寧波科生儀器有限公司);紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV-2550,島津公司);超純水器(TTL-10A,北京同泰聯(lián)科技發(fā)展公司);電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(山東濰紡醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司醫(yī)療器械廠);中草藥粉碎機(jī)(FW117,天津市泰斯特儀器有限公司);十萬(wàn)分之一分析天平(AUW220D,島津公司);萬(wàn)分之一電子天平(FA2004N,上海分析儀器);恒溫水浴鍋(HWS-5A,北京東方精瑞發(fā)展有限公司)。

1.3試劑

甲醇為色譜純;氨水、氯仿、磷酸為分析純;水為超純水;對(duì)照品苦參堿(110805-200306)、氧化苦參堿(0780-200004)購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢驗(yàn)所。

1.4色譜條件

色譜柱ZORBAX -C18柱(4.6mm×150mm,5μm);檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm;流動(dòng)相為0.04 moL/L磷酸-甲醇(90∶10);流速為1.0mL/min;柱溫為20℃。

1.5對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱定苦參堿對(duì)照品2.4mg和氧化苦參堿對(duì)照品10.8mg,用超純水定容至10mL容量瓶中,制成含苦參堿2.4μg/mL及氧化苦參堿10.8mg/mL的混合對(duì)照品母液。

1.6供試品溶液的制備

精密稱取試驗(yàn)材料0.5g,置于60mL具塞三角瓶中,加入2mL濃氨水使樣品潤(rùn)濕,再加入30mL氯仿,超聲提取30min,靜置4h,濾出上清液后再加氯仿超聲提取,共提取3次。合并3次濾液,80℃水浴回收氯仿至干。殘留物以超純水溶解,并定容于25mL容量瓶。

2結(jié)果與分析

2.1檢驗(yàn)波長(zhǎng)選擇

取苦參堿和氧化苦參堿對(duì)照品適量,分別用超純水配成標(biāo)準(zhǔn)溶液,在UV-2550紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)上于190~900nm進(jìn)行掃描。結(jié)果顯示,苦參堿和氧化苦參堿在220nm處有最大吸收,試驗(yàn)采用220nm為檢驗(yàn)波長(zhǎng)。

2.2出峰時(shí)間確定

在上述色譜條件下,分別進(jìn)1.5中配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液各10μL,檢測(cè)得苦參堿在4min處出峰,氧化苦參堿在9min處出峰。

2.3線性關(guān)系的考察

精密量取混合對(duì)照品母液0.25mL、0.50mL、1.00mL、2.00 mL、3.00mL用超純水定容至5.0mL容量瓶,得到苦參堿濃度梯度為12μg/mL、24μg/mL、48μg/mL、96μg/mL、192μg/mL和氧化苦參堿濃度梯度為54μg/mL、108μg/mL、216μg/mL、432μg/mL、648μg/mL的一組混合對(duì)照品溶液。經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過(guò),在色譜設(shè)定條件下依次進(jìn)樣10μL測(cè)定苦參堿、氧化苦參堿的峰面積。以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),得線性回歸方程。苦參堿的方程為Y=5.013 7 X+7.814,r=0.999 70;氧化苦參堿的方程為Y=5.499 X+4.53,r=0.999 92。結(jié)果見(jiàn)圖1。供試品溶液經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾后,在設(shè)定色譜條件下,取供試品溶液10μL進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取上述供試樣品溶液10μL,連續(xù)進(jìn)樣5次,利用外標(biāo)法測(cè)定樣品中苦參堿、氧化苦參堿濃度,RSD分別為0.245%、0.204%。

2.5穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取上述供試樣品溶液10μL,分別在2h、4h、8h、24h、48h進(jìn)樣,測(cè)定苦參堿、氧化苦參堿的濃度,RSD分別為0.326%、0.204%。結(jié)果表明,供試品溶液中的苦參堿、氧化苦參堿在48h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6重現(xiàn)性試驗(yàn)

取同一材料,按供試品溶液的制備方法平行制備5份,依上述方法測(cè)定苦參堿、氧化苦參堿濃度,RSD值分別為0.404%、0.311%。

2.7回收率試驗(yàn)

精密稱取已測(cè)定苦參堿、氧化苦參堿含量的樣品5份,每份0.5g,分別加入定量的苦參堿、氧化苦參堿,按供試品溶液的制備方法制備,測(cè)定,結(jié)果如表1。得苦參堿的平均回收率為100.990%,RSD值為2.122%;氧化苦參堿的平均回收率為99.180%,RSD值為0.098%。

2.8樣品含量測(cè)定

分別取苦豆和狼牙刺種子為試驗(yàn)樣品,按供試樣品溶液制備的方法處理樣品。分別精密吸取各供試樣品溶液10μL,進(jìn)樣分析檢測(cè),計(jì)算得苦豆和狼牙刺種子中苦參堿和氧化苦參堿含量(見(jiàn)表2)。

3討論

3.1色譜條件

試驗(yàn)分別用0.2%鹽酸提取法、甲醇提取法和氨水-氯仿提取法,結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用0.2%鹽酸提取法在蒸干時(shí)困難;甲醇提取法出現(xiàn)絮狀物,檢測(cè)困難;氨水-氯仿提取法溶液澄清,重復(fù)性好。

分別采用甲醇、乙醇、超純水定容對(duì)照品和樣品材料的提取物,進(jìn)行分析測(cè)定。用超純水定容的待測(cè)樣色譜圖基線穩(wěn)定,峰形對(duì)稱,重復(fù)性、穩(wěn)定性良好,可用于定性、定量分析檢測(cè),為本試驗(yàn)最終選擇。

試驗(yàn)采用酸性流動(dòng)相,出峰時(shí)間短,且隨流動(dòng)相pH值的減小,峰形對(duì)稱性越好,基線越平直?？紤]到酸性對(duì)設(shè)備的使用壽命的影響,最終采用0.04moL/L磷酸溶液(pH值1.8)-甲醇為流動(dòng)相,并采用能耐受酸性環(huán)境的ZORBAX-C18(4.6mm×150mm,5μm)色譜柱,檢測(cè)效果良好。

3.2含量分析比較

從苦豆和狼牙刺種子中的苦參堿和氧化苦參堿含量測(cè)定結(jié)果可以看出,狼牙刺種子更具優(yōu)勢(shì)。在制備以苦參堿和氧化苦參堿為主的生物產(chǎn)品時(shí),可以適當(dāng)考慮用狼牙刺種子作為材料?？喽棺鳛橐环N中藥材已有廣泛運(yùn)用,狼牙刺種子苦參類生物堿雖然含量高,但能否可當(dāng)作廣泛使用的中藥材還需進(jìn)一步研究。

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