李利斌　王殿峰　劉立峰　劉國(guó)明　高建偉

摘要：運(yùn)用比較基因組學(xué)的方法，首次從大白菜基因組中鑒定出一個(gè)與擬南芥中控制種子和器官大小的基因DAl同源的序列BrDA1，并對(duì)這個(gè)基因和編碼蛋白的結(jié)構(gòu)以及順式反應(yīng)元件進(jìn)行了系統(tǒng)分析。結(jié)果表明，BrDA1具有LIM家族和鋅指蛋白的結(jié)構(gòu)特征，而且還有和泛素互作的位點(diǎn)?？赡芫哂泻虯tDA1相似的功能。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，在大白菜和擬南芥DA1基因的啟動(dòng)子序列中存在多個(gè)能夠響應(yīng)不同激素和逆境信號(hào)的順式反應(yīng)元件。這說(shuō)明，植物DA1基因不僅與種子和器官發(fā)育有關(guān)，而且與激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和逆境響應(yīng)存在密切關(guān)系。本文為進(jìn)一步研究DA1基因在大白菜生長(zhǎng)發(fā)育和逆境響應(yīng)中的功能以及與大白菜雜種優(yōu)勢(shì)的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：大白菜；DA1；結(jié)構(gòu)；順式反應(yīng)元件

中圖分類(lèi)號(hào)：S634.1；Q343.1⁺2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942(2009)07-0001-03

植物器官大小特別是經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量部分器官的大小是影響植物產(chǎn)量的重要因素和衡量植物雜種優(yōu)勢(shì)的重要指標(biāo)，這些性狀也是受基因控制的。近年來(lái)多個(gè)控制植物器官大小的基因被克隆并得到功能驗(yàn)證，如馬鈴薯的EBP1，擬南芥中控制器官大小和發(fā)育的基因KLUH、ARF2、AP2、ANT、BB等，水稻中控制抽穗期和穗粒數(shù)的基因GDH7。影響種子大小的基因GW2、GIF1和GW5。最近，李云海等(2008)克隆了一個(gè)最終控制種子和器官大小的擬南芥基因DAl(AtDA1)。AtDA1編碼一個(gè)含有LIM結(jié)構(gòu)域的能夠和泛素相互作用的C3HCA類(lèi)鋅指蛋白，負(fù)向調(diào)控種子和器官大小，該基因突變后植株的種子和器官明顯增大。因此，AtDA1類(lèi)基因在種子和器官發(fā)育過(guò)程中具有重要功能，值得廣泛和深入研究。植物雜種優(yōu)勢(shì)的遺傳和分子機(jī)理研究以往多采用差異表達(dá)的方法，對(duì)雜種和親本的基因表達(dá)調(diào)控從核酸和蛋白水平進(jìn)行比較研究，找到多個(gè)在雜種和親本間顯著差異表達(dá)的基因或者蛋白，但是這些基因或者蛋白很難和植物的性狀聯(lián)系起來(lái)。本文作者認(rèn)為，直接從控制性狀的基因特別是和植物雜種優(yōu)勢(shì)表現(xiàn)密切相關(guān)的性狀的基因。如控制植物種子和器官大小的基因人手來(lái)研究植物雜種優(yōu)勢(shì)的分子機(jī)理，可能會(huì)更加富有成效。

本文利用比較基因組學(xué)和生物信息學(xué)的方法首次從大白菜基因組中鑒定出一個(gè)AtDA1的同源基因，并對(duì)這個(gè)基因的序列特征、編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域和順式反應(yīng)元件進(jìn)行了系統(tǒng)分析，為進(jìn)一步研究它在大白菜生長(zhǎng)發(fā)育中的功能以及與大白菜雜種優(yōu)勢(shì)的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法

根據(jù)擬南芥的DA1基因和蛋白序列，通過(guò)各種序列比對(duì)在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索大白菜的同源序列。利用基因組序列解析得到全長(zhǎng)編碼區(qū)序列，并在數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行手工比對(duì)和分析。根據(jù)基因組序列和編碼區(qū)序列的信息，研究基因的外顯子和內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，并解析得到啟動(dòng)子區(qū)序列和預(yù)測(cè)編碼的蛋白序列。然后利用PLANTCARE對(duì)啟動(dòng)子序列中的順式反應(yīng)元件進(jìn)行分析，利用Pla-ntsP Feature Scan對(duì)蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)和分析。

2結(jié)果與分析

2.1大白菜DA1基因的鑒定和特征分析

利用比較基因組學(xué)和生物信息學(xué)的方法從大白菜基因組中得到一個(gè)與擬南芥DA1同源的基因，命名為BrDA1。BrDA1與AtDA1的核苷酸序列一致性高達(dá)86.73％，二者預(yù)測(cè)編碼蛋白的序列一致性為87.10％。BrDA1基因組序列長(zhǎng)為2278bp，編碼區(qū)為1584bp，預(yù)測(cè)編碼一個(gè)含有527個(gè)氨基酸殘基、分子量為59.67ku的蛋白。這個(gè)基因位于大白菜的BAC克隆AC172888.2(47086～49363)中，含有9個(gè)外顯子，其外顯子和內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)如圖1所示。

2.2大白菜DA1基因的順式反應(yīng)元件分析

基因的表達(dá)主要是其順式作用元件和反式作用因子相互作用的結(jié)果，通過(guò)分析啟動(dòng)子及其上游序列的順式反應(yīng)元件可以預(yù)測(cè)基因的功能。因此，本研究在得到BrDA1的基因組序列以后，取起始密碼子上游2000bp的序列進(jìn)行順式元件分析，結(jié)果(表1)表明。在BrDA1起始密碼子上游2000bp的范圍內(nèi)共有10種不同的順式反應(yīng)元件，包括四個(gè)脫落酸響應(yīng)元件ABRE，赤霉素響應(yīng)元件TATC－box和P－box各一個(gè)，一個(gè)茉莉酸甲酯響應(yīng)元件CGTCA，三個(gè)水楊酸響應(yīng)元件TCA，一個(gè)熱激應(yīng)答元件HSE，一個(gè)干旱響應(yīng)元件MBS，與防衛(wèi)反應(yīng)有關(guān)的富含AT和TC的響應(yīng)元件各一個(gè)，還有兩個(gè)胚乳特異表達(dá)順式反應(yīng)元件Skn－1。另外，通過(guò)對(duì)擬南芥DA1啟動(dòng)子區(qū)的分析，也發(fā)現(xiàn)了多個(gè)能響應(yīng)逆境和激素信號(hào)的順式元件(表2)，這與擬南芥DAI受ABA誘導(dǎo)表達(dá)的結(jié)果一致。這些結(jié)果顯示，植物DA1基因可能不僅與種子和器官發(fā)育有關(guān)，而且與植物逆境響應(yīng)和激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)密切相關(guān)。

2.3大白菜DA1基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)分析

為了研究大白菜DA1的功能，在解析得到它的編碼序列后，對(duì)其預(yù)測(cè)編碼的蛋白進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果顯示，BrDA1蛋白含有兩個(gè)泛素互作位點(diǎn)，一個(gè)LIM結(jié)構(gòu)域，一個(gè)zf－C3HCA結(jié)構(gòu)域，一個(gè)鋅離子結(jié)合區(qū)和跨膜結(jié)構(gòu)域，還有8個(gè)潛在的豆蔻?；稽c(diǎn)(見(jiàn)表3)。這說(shuō)明BrDA1蛋白具有LIM蛋白和鋅指蛋白的結(jié)構(gòu)特征，而且可能能夠與泛素結(jié)合和被豆蔻?；＿@說(shuō)明BrDA1蛋白可能具有與擬南芥DA1類(lèi)似的功能，作為負(fù)調(diào)控因子來(lái)調(diào)控細(xì)胞的分裂過(guò)程，從而影響種子和器官的發(fā)育和大小。

3討論與結(jié)論

本研究利用比較基因組學(xué)和生物信息學(xué)的方法從大白菜基因組中鑒定出一個(gè)與擬南芥DA1同源的基因BrDA1，并對(duì)這個(gè)基因和編碼蛋白的結(jié)構(gòu)以及順式反應(yīng)元件進(jìn)行了系統(tǒng)分析。分析結(jié)果表明，BrDA1具有LIM家族和鋅指蛋白的結(jié)構(gòu)特征，而且還有和泛素互作的位點(diǎn)，可能具有和AtDA1相似的功能。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，在大白菜和擬南芥DA1基因的啟動(dòng)子序列中存在多個(gè)能夠響應(yīng)不同激素(如脫落酸ABA和水楊酸SA)和逆境信號(hào)(如熱脅迫、干旱脅迫和病原物等)的順式反應(yīng)元件，而脫落酸和水楊酸在植物非生物逆境和抗病反應(yīng)過(guò)程中具有重要功能。這說(shuō)明，植物DA1基因不僅與種子和器官發(fā)育有關(guān)，而且與激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和逆境響應(yīng)存在密切關(guān)系。植物DA1基因?qū)Σ煌婢澈图に匦盘?hào)的響應(yīng)模式、在不同組織器官和發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況及與植物雜種優(yōu)勢(shì)的關(guān)系值得深入細(xì)致探討。本研究為下一步研究DA1基因在大白菜生長(zhǎng)發(fā)育和逆境響應(yīng)中的功能以及與大白菜雜種優(yōu)勢(shì)的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。