蔣冬花,徐曉波,葉瑩瑩,嵇 豪,蔡琪敏

(浙江師范大學化學與生命科學學院,浙江金華 321004)

酵母菌是一類重要的微生物,對其分類與鑒定是人類開發(fā)利用的基礎。傳統(tǒng)的酵母菌鑒定方法所依賴的形態(tài)和生理生化特征均是表型性狀,會隨著環(huán)境的變化有所改變,這樣就會造成菌株鑒定結(jié)果的不穩(wěn)定性。隨著DNA分子標記技術(shù)的引入給微生物分類鑒定帶來了積極的推動作用,使分類鑒定工作由一般的表型特征鑒定深化到分子水平和遺傳特征的鑒定。SRAP是一種基于PCR技術(shù)的新的DNA分子標記,由Li和Quiros[1]于2001年提出,具有簡便、穩(wěn)定、中等產(chǎn)率和容易得到選擇條帶序列的特點。SRAP利用其獨特的引物設計對基因組的開放閱讀框(ORFs)進行特異擴增,上游引物長17 bp,對外顯子進行特異擴增,下游引物長18 bp,對內(nèi)含子區(qū)域、啟動子區(qū)域進行特異性擴增,因個體不同以及物種的內(nèi)含子、啟動子和間隔序列的不同,產(chǎn)生基于內(nèi)含子和外顯子的SRAP多態(tài)性[2]。用于SRAP實驗的引物包括1個含17個堿基的正向引物(F-pr imer)和1個含18個堿基的反向引物(R-primer),正向引物含有一段14個堿基的核心序列,5′端前10個為填充序列TGAGTCCAAA,無任何特異組成,接著為CCGG序列,隨后3′端為3個不同的選擇性堿基,與相同的核心序列組成一套正向引物。反向引物的5′端前11個為填充序列GACTGCGTACG,接著為AATT,隨后3′端同樣為3個不同的選擇性堿基[3-4]。SRAP標記已經(jīng)在馬鈴薯、水稻、蘋果、柑橘類果樹、櫻桃、梅子、油菜、大蒜、萵苣和棉花等[5-9]植物研究中得到了應用,具有簡便、穩(wěn)定、中等產(chǎn)率的特點,在基因組中分布均勻,適合基因定位、基因克隆等分子生物學研究。但是在真菌中的應用很少,尤其是在酵母菌中的應用未見報道。本研究應用SRAP標記對實驗室保藏的19株待鑒定的酵母進行分子標記鑒定,檢測這種分子標記技術(shù)用于酵母菌菌種鑒別的可行性,為酵母菌的遺傳分析和分類研究提供DNA水平的證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 從梨、蘋果、葡萄、獼猴桃等水果表皮不同部位,果園土、泡菜、酒曲等場所分離篩選純化得到18株酵母菌菌株,分別編號為Y-2～Y-19;浙大紫金港微生物實驗室提供標準啤酒酵母(Saccharom yces cerevisiae)菌株作為參照菌株,并將其編號為Y-1。

1.1.2 試劑 用于SRAP-PCR反應的dNTPs、TaqDNA聚合酶及DL 2000TMDNA Marker均購自寶生物工程(大連)有限公司。本實驗使用的引物包括8個正向引物和11個反向引物,共組合成88個引物對,其序列見表1,引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

表1 SRAP實驗的引物序列Table 1 Sequences of primers used in SRAP analysis

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 使用T IANamp YeastDNA Kit提取酵母基因組DNA,試劑盒購于北京科百奧生物科技有限責任公司。用0.8%的瓊脂糖電泳檢測DNA質(zhì)量,通過紫外分光光度計測定DNA的濃度和純度,并將DNA濃度稀釋為50 ng/μL。

1.2.2 引物的篩選 通過組合8對正向引物和11對反向引物得到88對引物組合,利用這些引物組合對酵母Y-1進行擴增實驗,從中篩選出帶形清晰,多態(tài)性豐富的引物。擴增反應體系總體積為25μL,含50 ng模板DNA,50 ng引物,1.5 μL dNTPs(2.5 mmol/L),2.0μLMgCl2(25 mmol/L),1.0 UTaqDNA聚合酶,1×PCR緩沖液。反應程序為：94℃預變性5 min;94℃變性1 min,35℃退火1 min,72℃延伸1 min,擴增5個循環(huán);94℃變性1 min,50℃退火1 min,72℃延伸1 min,擴增35個循環(huán);72℃延伸10 min。

1.2.3 PCR正交設計試驗[10-11]為確定PCR反應中各因素最佳水平,以酵母Y-1的DNA為模板,使用1.2.2所得結(jié)果的引物組合,采用L16(45)正交法,對影響SRAP擴增的主要因素Mg2+、dNTPs、DNA模板、引物、TaqDNA聚合酶設計5因素4水平的正交試驗,以確定PCR電泳分析的最佳條件。正交設計中的16個處理重復3次,PCR反應各因素水平見表2和表3。

表2 SRAP-PCR體系因素-水平Table 2 SRAP-PCR factors-levels

表3 SRAP-PCR正交試驗設計(L16(45))Table 3 SRAP-PCR orthogonal design(L16(45))

續(xù)表

1.2.4 DNA多樣性聚類分析 在最適條件下進行PCR擴增,PCR擴增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳中分離獲得擴增圖譜,根據(jù)同一位點帶的有無編成1,0矩陣輸入計算機,用NTSYSpc軟件中的S IMQUA I程序計算菌株間的相似系數(shù),然后用UPG MA法進行聚類分析,構(gòu)建相似聚類樹狀圖。

2 結(jié) 果

2.1 引物篩選結(jié)果

用88對SRAP引物對酵母Y-1進行PCR擴增,其中me2-em7、me2-em10、me3-em4、me3-em6、me3-em8、me4-em2、me4-em5、me4-em9、me4-em10、me5-em7、me5-em8、me5-em10、me6-em8、me8-em5共14對引物擴增產(chǎn)物的條帶清晰、重復性和穩(wěn)定性好且多態(tài)性條帶相對較多,因此選用上述14對引物進行19個供試菌株的SRAP擴增實驗(圖1)。

圖1 部分SRAP引物篩選結(jié)果Fig.1 Result of primers screening for SRAP

2.2 PCR正交試驗設計的結(jié)果分析

按表3設計的16個處理進行PCR試驗,電泳檢測結(jié)果見圖2,使用正交設計助手Ⅱ進行結(jié)果分析,極差分析結(jié)果見表4。依據(jù)瓊脂糖電泳條帶的強弱和雜帶的多少進行直觀分析。PCR的擴增結(jié)果是dNTPs、引物、DNA模板、Mg2+和Taq酶等因素綜合作用的結(jié)果。從表4中可以看出,極差R值越大,說明該因素對PCR擴增結(jié)果影響越大,因此5個因素水平變化對SRAP-PCR擴增結(jié)果的影響從大到小依次為dNTPs濃度＞引物濃度＞DNA模板濃度＞Mg2+濃度＞Taq酶濃度,即dNTPs濃度的影響最為顯著。

2.2.1 dNTPs濃度對于PCR擴增結(jié)果的影響dNTPs濃度在150μmol/L時擴增效果最好,之后呈現(xiàn)直線下降趨勢,每2個水平之間差異都達到顯著水平。由關(guān)系曲線的波動幅度可知(圖3),dNTPs濃度對PCR結(jié)果影響較大。本實驗選擇峰值150μmol/L為最佳反應水平。

2.2.2 引物濃度對PCR擴增結(jié)果的影響 引物濃度為0.2μmol/L和0.3μmol/L在水平間表現(xiàn)無顯著差異,但是兩者均與0.4μmol/L、0.5 μmol/L在水平間差異顯著。引物的濃度高低會影響產(chǎn)物的特異性,最佳引物濃度一般在0.1～0.5μmol/L,以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為最佳,引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增,且會增加引物之間形成二聚體的機會。因此,應選擇拐點0.3μmol/L為最佳水平(圖3)。

2.2.3 模板DNA濃度對PCR擴增結(jié)果的影響模板DNA的濃度和純度對PCR擴增結(jié)果都會有一定的影響,DNA濃度過低,可能導致擴增結(jié)果不穩(wěn)定及擴增條帶模糊;濃度過高,則可能使引物或dNTPs過早耗盡,底物過量擴增,過早進入線性階段,出現(xiàn)擴增結(jié)果不穩(wěn)定的假象。如圖3所示,當DNA取峰值30 ng/25μL時,反應體系穩(wěn)定,在保證擴增效果的前提下,應盡量降低模板DNA的用量,因此,最終選定30 ng/25μL作為本實驗的最佳反應水平。

2.2.4 Mg2+濃度對PCR擴增結(jié)果的影響Mg2+濃度影響PCR擴增的多個方面,如DNA聚合酶的活性,這會影響PCR擴增的產(chǎn)量;再如引物退火,這會影響擴增產(chǎn)物的特異性。dNTPs和模板DNA同Mg2+結(jié)合,降低了酶活性所需要的游離Mg2+的量。最佳的Mg2+濃度對于不同的引物和模板都不同。如圖3所示,Mg2+濃度在2.0 mmol/L與2.5 mmol/L水平間差異不顯著,與其他兩個濃度在水平間差異顯著。較高的游離Mg2+濃度會增加非特異性擴增,降低忠實性;Mg2+濃度過低會降低Taq酶的活性,使反應產(chǎn)物減少。綜合各因素最終確定2.0 mmol/L為最佳水平。

2.2.5 Taq酶濃度對PCR擴增結(jié)果的影響 在100μL的典型PCR反應體系中,Taq聚合酶的用量一般為1～2.5單位,Taq聚合酶含量偏少時PCR產(chǎn)物相應減少,而Taq聚合酶含量過高時則會增加非特異性擴增的機會。如圖3所示,Taq聚合酶各水平間差異均不明顯,說明Taq聚合酶在本實驗所選梯度范圍內(nèi)對PCR擴增反應結(jié)果影響較小。由圖2可知,當Taq聚合酶濃度為1.5 U時,反應體系不穩(wěn)定。因此,本實驗最終選定Taq聚合酶濃度2.5 U/25μL作為最佳反應水平。

2.2.6 SRAP-PCR擴增最佳反應體系 通過正交設計實驗,得到用于酵母菌種分類的SRAPPCR擴增反應的最佳體系。25μL反應體系包括：dNTPs 150μmol/L,引物0.3μmol/L,模板DNA 30 ng,Mg2+2.0 mmol/L,Taq聚合酶2.5 U。

表4 SRAP-PCR正交試驗設計極差分析/L16(45)Table 4 The range analysis of SRAP-PCR orthogonal design/L16(45)

2.3 SRAP擴增結(jié)果

在最適的SRAP擴增條件下,對供試的19株酵母菌的DNA進行了14對引物的SRAP擴增實驗,經(jīng)重復試驗(3次)擴增結(jié)果穩(wěn)定。部分引物組合對供試菌株的擴增結(jié)果見圖4～圖8。

圖8 引物me4-em9對供試菌株的擴增結(jié)果Fig.8 Amplification products generated from tested strainswith primerme4-em9

表5 19株酵母菌株SRAP擴增的總條帶數(shù)和多態(tài)性條帶數(shù)Table 5 Total bands and polymorphic bands resulting from SRAP

14對引物共擴增出279條帶,其中92.5%呈多態(tài)性(見表5),每對引物平均擴增出20條帶。引物組合me4-em9擴增出來的總條帶最多為27條,多態(tài)性條帶為25條。引物組合me3-em4、me4-em2、me6-em8和me8-em5擴增出來的多態(tài)性條帶比例最高,都達到了100%,可以將19株酵母菌株完全區(qū)別開來。以上述14對引物擴增的產(chǎn)物圖譜為依據(jù),對供試的19株酵母菌株進行聚類分析。

2.4 SRAP擴增產(chǎn)物聚類分析

采用NTSYSpc軟件中的S IMQUA I程序進行數(shù)據(jù)分析計算兩兩菌株間的遺傳相似系數(shù)。供試的19個酵母菌株相似系數(shù)范圍為0.60～1.00。與ISSR的鑒定結(jié)果類似,Y-12酵母與其他酵母的相似系數(shù)較低。相似系數(shù)最高的菌株是Y-2和Y-4,兩者的相似系數(shù)達到了1.00。

圖9 SRAP聚類分析樹形圖Fig.9 Dendrogram based on SRAP fingerprints

如圖9所示,在相似水平為71%處時,供試的19株酵母菌株被劃分為4個類群。第Ⅰ群：Y-6、Y-18、Y-14、Y-7、Y-2、Y-4;第Ⅱ群：Y-12;第Ⅲ群：Y-3、Y-11、Y-16、Y-5、Y-8、Y-13、Y-17、Y-1、Y-19、Y-10、Y-9;第Ⅳ群：Y-15。

3 討 論

SRAP是一種新型的分子標記技術(shù),已經(jīng)成功地應用在多種植物的研究中,它適于在不同作物上用于各種目的的研究[12]。對于SRAP分子標記技術(shù)而言,不同的材料所需要的PCR反應體系是不同的,為了讓所選菌種擴增出理想的產(chǎn)物,必須優(yōu)化PCR反應體系[13]。模板濃度、dNTPs濃度、Mg2+濃度和退火溫度等因素都會對擴增結(jié)果產(chǎn)生影響,本次試驗中dNTPs濃度和引物濃度是主要影響因素。SRAP擴增獲得的條帶十分豐富,該分子標記技術(shù)的引物擴增產(chǎn)物為基因區(qū)域,這意味著將不能揭示非基因區(qū)域的遺傳多樣性[12]。形態(tài)上有明顯差異的菌株,SRAP擴增條帶也有明顯區(qū)別,但是,形態(tài)上相似的菌株之間譜帶差異很小,種內(nèi)菌株之間幾乎是沒有差異的。對于SRAP分子標記技術(shù)而言,引物組合的選擇是關(guān)鍵,正向引物和反向引物的自由組合不僅增加了引物的多樣性,而且節(jié)省了引物合成的成本,本文中使用的SRAP引物是目前文獻中報道的部分標準引物序列[13-14]。本研究結(jié)果顯示,不同的SRAP引物組合對不同酵母菌種間的區(qū)分度有所不同。在利用該標記技術(shù)進行分類鑒定及親緣關(guān)系研究時,應盡量選用多種引物進行擴增反應,在綜合大量譜帶信息的基礎上在進行聚類分析。

本研究利用SRAP分子標記獲得的多態(tài)性條帶,對實驗室分離純化得到的19株酵母菌在一定的程度上進行區(qū)分,比較適合于酵母菌的種間鑒別。要將這19株酵母菌準確鑒定到種的水平,還需結(jié)合其他輔助手段一起進行,如26S r DNA D1/D2區(qū)序列分析和5.8S rDNA-ITS區(qū)域的PCRRFLP分析等,每種技術(shù)手段都有各自的優(yōu)缺點,多種技術(shù)手段的結(jié)合才能大大提高酵母菌種鑒定的準確性。本研究對SRAP分子標記技術(shù)的成功應用為今后酵母菌屬真菌的種系鑒定、遺傳多樣性研究、指紋圖譜構(gòu)建以及遺傳連鎖圖譜構(gòu)建等奠定了重要基礎。

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