賀 敬 李 壯 王英娟 馬 濤 蔣海亮(西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,陜西西安市 710069)

微藻的固定化技術(shù)及應(yīng)用研究▲

賀 敬 李 壯 王英娟3馬 濤 蔣海亮(西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,陜西西安市 710069)

微藻;固定化;應(yīng)用前景

微藻作為當(dāng)今研究的熱點(diǎn),具有生長(zhǎng)速率快、油脂產(chǎn)量高、碳水化合物和其他營(yíng)養(yǎng)成分豐富的優(yōu)點(diǎn),可用于生物制藥、生產(chǎn)生物柴油、提取必需脂肪酸、激光醫(yī)療和污水處理等領(lǐng)域[1]。但由于微藻個(gè)體微小,常規(guī)的生物技術(shù)很難應(yīng)用于微藻,而微藻的固定化技術(shù)恰恰解決了這一問題。固定化技術(shù)使微藻在污水處理、吸收富集營(yíng)養(yǎng)、種質(zhì)保藏、代謝物生產(chǎn)等方面的能力大大提高[2]?，F(xiàn)對(duì)微藻的固定化技術(shù)的方法及其應(yīng)用研究綜述如下。

1 微藻的固定化方法

微藻固定化技術(shù)主要有吸附法、包埋法、偶聯(lián)法[3～5]三種方法 ,見表 1。

1.1 吸附法 微藻細(xì)胞可通過靜電吸附結(jié)合在固相載體表面。固相載體表面可形成單層和多層的微藻細(xì)胞層。由于,這種固定化技術(shù)操作簡(jiǎn)便,成本低廉,因此得到了廣泛的應(yīng)用。被固定的微藻結(jié)合的強(qiáng)度不一,固定微藻經(jīng)常容易脫離進(jìn)入培養(yǎng)液中,而培養(yǎng)液中懸浮微藻細(xì)胞也可吸附在固相載體表面,形成動(dòng)態(tài)平衡。由于,該方法操作簡(jiǎn)單而常被用于微藻細(xì)胞的固定,但微藻細(xì)胞的截留量卻因吸附載體不同而受到限制[6]。

吸附法常用的固相載體包括纖維素載體 (如二乙氨乙基纖維素、鋸末、脫木素鋸末等)和無機(jī)載體 (如坡縷石、高嶺石、水云母、多孔瓷器、多孔玻璃等)。這些固相載體往往還需進(jìn)行表面修飾以增強(qiáng)對(duì)微藻的吸附力,如玻璃、纖維素薄膜等載體則可經(jīng)聚陽(yáng)離子、殼聚糖或者其他化學(xué)物質(zhì)的表面修飾后,用于微藻細(xì)胞的固定。

1.2 包埋法 包埋法是將微藻細(xì)胞截留在水不溶性的凝膠絡(luò)合物的網(wǎng)絡(luò)空間中,通過聚合作用,或通過離子網(wǎng)絡(luò)形成,或通過沉淀作用,或改變?nèi)軇?、溫度、pH值使細(xì)胞截留[7]。此方法具有高的保留容量,對(duì)細(xì)胞無毒性,但操作方法復(fù)雜[8]。包埋法常用的載體有:瓊脂、藻酸鹽、交叉菜糖、骨膠原、果膠等。

1.3 偶聯(lián)法 具有多個(gè)相同功能基團(tuán)的偶聯(lián)劑,通過與微藻細(xì)胞表面的基團(tuán)反應(yīng),從而使微藻細(xì)胞相互連接呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)而達(dá)到固定的目的[9]。用此方法固定的微藻細(xì)胞不易流失,操作簡(jiǎn)單,但由于固定過程的劇烈反應(yīng),對(duì)微藻細(xì)胞產(chǎn)生一定的毒性,影響微藻細(xì)胞活力。常用的偶聯(lián)劑有戊二醛、異氰酸、氨基硅烷、碳化二亞胺等。

就目前而言,微藻固定的三種方法中,吸附法和包埋法具有操作相對(duì)簡(jiǎn)便、成本較低、對(duì)細(xì)胞傷害較小等優(yōu)點(diǎn)而常被采用。但吸附法細(xì)胞保留量較小,所以包埋法成為目前最為廣泛應(yīng)用的固定方法,而且包埋載體又以藻酸鈣或 K2交叉藻聚糖較為適宜。

表 1 幾種固定方法的比較

2 固定化對(duì)微藻的影響

微藻經(jīng)固定后,生活環(huán)境的改變會(huì)對(duì)微藻細(xì)胞造成一定的影響。首先,固定微藻所用的樹脂、高分子聚合物等有機(jī)載體對(duì)微藻細(xì)胞有一定的毒性[10],影響正常的細(xì)胞活力。其次,與自由懸浮培養(yǎng)的微藻相比,固定化的微藻具有一個(gè)較長(zhǎng)的停滯期,當(dāng)停滯期過后,固定化的微藻才會(huì)呈現(xiàn)出與自由懸浮培養(yǎng)的微藻細(xì)胞相似的生長(zhǎng)曲線[11]。此外,固定化微藻形態(tài)會(huì)因固定化而受到一定程度的影響。Lukavsky等[12]比較了固定的 S.quadricauda、C.kessleri和其游離懸浮培養(yǎng)的形態(tài),發(fā)現(xiàn)C.kessleri細(xì)胞的大小和形狀未發(fā)生顯著變化,但細(xì)胞器變得更多,開始出現(xiàn)淀粉粒;而 S.quadricauda出現(xiàn)了更多的異型細(xì)胞[12]。

固定之后,藻類的生長(zhǎng)和生理特性發(fā)生了變化,可以提高對(duì)氮、磷和重金屬等物質(zhì)的吸收和富集。但是目前這方面的研究還很不系統(tǒng),一般認(rèn)為固定化提高了藻類的合成代謝活性,延遲衰老,并在一定程度上降低了藻類的分解代謝活性。

3 微藻固定化培養(yǎng)的應(yīng)用

3.1 在傳統(tǒng)的微藻懸浮游離培養(yǎng)中細(xì)胞增殖較快,但形成的次生代謝產(chǎn)物的量較少。相反,固定化培養(yǎng)不僅能使細(xì)胞生長(zhǎng)速度減慢,便于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),轉(zhuǎn)化為次生產(chǎn)物,而且 a2海藻酸鈉固定的微藻中可檢測(cè)到類苯基丙烷復(fù)合物,這是非常重要的結(jié)果。

3.2 種質(zhì)保藏 藻種長(zhǎng)期較好地保藏可大大節(jié)省人力和物力,固定化技術(shù)可作為微藻種質(zhì)保藏的重要方法之一[13]。Chan等[14]將 S.quadricauda、I.galbana用鈣 -海藻酸鈉包埋,在無培養(yǎng)基、4℃、暗光的環(huán)境中保存 3年后,將微藻細(xì)胞用新鮮培養(yǎng)基復(fù)蘇,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞依然具有活性,在四周內(nèi)增殖了40代。Hertzberg等[15]用鈣 -海藻酸鈉包埋 P.tricornutum細(xì)胞,在暗光、4℃下保藏 1年,將其復(fù)蘇后,微藻可釋放氧氣。Lukavsky等[16]用 2%的瓊脂固定了 31種原核和真核微藻,在低溫下保藏一年后,大多數(shù)仍具有代謝活性。Joo等[17]用鈣 -海藻酸鈉固定了 D.bardawil,C.minutissima,P.lutheri and H.pluvialis四種微藻,得到了比游離培養(yǎng)基更高的細(xì)胞密度。胡蓓娟等[18]對(duì) 8種微藻采用固定化和低溫弱光 2種方法進(jìn)行保存作了比較,發(fā)現(xiàn)只有三角褐指藻、藍(lán)隱藻和小球藻較適合固定化保存。由此可見,固定化微藻的保種技術(shù)在某些藻類是可行的。

3.3 產(chǎn)生能源 氫氣由于具有熱值高、來源廣泛、無污染的優(yōu)點(diǎn),因此是一種優(yōu)良的燃料。生物合成氫氣相比化學(xué)合成更環(huán)保、能源消耗更少[19]。一些微藻可在脅迫條件下產(chǎn)生氫氣,如綠藻在缺少硫元素的時(shí)候由于不能合成光反應(yīng)中關(guān)鍵蛋白而產(chǎn)生氫氣[20,21]。因此,利用包埋法將微藻固定在特定脅迫條件的培養(yǎng)環(huán)境中,即用于產(chǎn)生氫氣。Melis等[22]通過兩步法在硫饑餓的培養(yǎng)條件下,間接光解制氫,基于固定化技術(shù)的培養(yǎng)條件使產(chǎn)氫量遠(yuǎn)高于一般的培養(yǎng)方法。有報(bào)道等[23]比較兩種延長(zhǎng)固定化硫饑餓微藻細(xì)胞 Chlamydomonas reinhardtii產(chǎn)氫時(shí)間的方法后發(fā)現(xiàn),將固定化的微藻細(xì)胞交替置于高硫和低硫的培養(yǎng)環(huán)境中,可延長(zhǎng)微藻的產(chǎn)氫時(shí)間。

3.4 脫氮除磷 利用富營(yíng)養(yǎng)污水培養(yǎng)微藻,在提供了微藻生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)的同時(shí),也降低了水體中氮磷的含量,從而使污水得到了凈化,但這種培養(yǎng)系統(tǒng)占地面積大,成本高,微藻從中分離出來需離心過濾,耗時(shí)耗力。固定化微藻由于固定化載體對(duì)氮磷具有一定的吸附富集作用,對(duì)環(huán)境等的變化具有一定的緩沖作用,同時(shí)固定化微藻與自由懸浮微藻相比較,顯示出更強(qiáng)的增長(zhǎng)性和生理活性,使得固定化微藻具有處理效率高、對(duì) pH值、溫度、有毒物質(zhì)和有機(jī)溶劑等環(huán)境變化承受能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[24,25],常被用于微藻培養(yǎng)的脫氮除磷中。Canizares等[26]對(duì)懸浮螺旋藻和角叉菜聚糖固定螺旋藻處理造酒廢水進(jìn)行了比較研究,懸浮藻對(duì) NH4+2N、PO4

3-2P和總磷的去除率分別為 75%、98%和 53%,而固定藻對(duì)氮、磷的去除率均在 90%以上。王瑞旋等[27,28]將固定化波吉囊藻和微綠球藻引入凡納對(duì)蝦的養(yǎng)殖環(huán)境中,發(fā)現(xiàn)波吉囊藻對(duì)氨氮的吸收能力較強(qiáng),而固定化微綠球藻對(duì)亞硝酸鹽的吸收力較強(qiáng)。Aguilar等[29]分別培養(yǎng)殼聚糖固定的海洋藍(lán)藻 Synechococcus和游離的 Synechococcus,用于吸收水體中的氮元素和磷元素,發(fā)現(xiàn)前者的吸收效率遠(yuǎn)高于后者。

3.5 去除重金屬離子及其他污染物 重金屬元素進(jìn)入環(huán)境后,不僅造成資源浪費(fèi),更能造成嚴(yán)重的環(huán)境污染,對(duì)人類自身安全產(chǎn)生持久的威脅。重金屬?gòu)U水的傳統(tǒng)處理方法主要有離子交換法、化學(xué)沉淀法、電解法、反滲透法、吸附法、不溶性絡(luò)合物法、氧化還原法、蒸發(fā)濃縮法等[30,31]。這些方法技術(shù)要求較高,而且費(fèi)時(shí)費(fèi)力,容易造成二次污染。微藻固定化技術(shù)在增加單位體積生物量、提高處理負(fù)荷的同時(shí),減少了解吸過程中微藻的損失量,并且固定化載體對(duì)重金屬離子具有吸附富集作用,對(duì)其毒性具有緩沖作用,從而使得固定化微藻具有更高的處理效率和吸附量[32],在去除重金屬離子及其他污染物方面優(yōu)于傳統(tǒng)處理方法。Ergene等[33]通過褐藻酸凝膠固定綠藻 Scendesmus quadricauda,用來去除水環(huán)境中的亮藍(lán)顏料,發(fā)現(xiàn)在初始亮藍(lán)燃料濃度為 150 mg/L、pH 2.0、30℃時(shí),固定化的微藻具有非常高的吸收效率。嚴(yán)國(guó)安等[34,35]利用褐藻酸鈉固定化的斜生柵藻對(duì) Hg2+的去除率明顯高于懸浮藻,并且污水中 Hg2+的濃度大小對(duì)于 2種狀態(tài)斜生柵藻的去除率也有一定影響。

3.5 毒性檢測(cè) 由于微藻細(xì)胞高的比表面積,使其對(duì)環(huán)境中不同的污染物具有較高的敏感性,因此在水污染監(jiān)測(cè)中,微藻成為了一種重要的檢測(cè)工具,也得到了美國(guó)環(huán)保署、國(guó)際經(jīng)合與發(fā)展組織、國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織等的認(rèn)可[36,37]。目前,已將固定化微藻引入環(huán)境監(jiān)測(cè),提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性和應(yīng)用范圍。Pandard等[38]用小球藻 Chlorella vulgaris和柵藻 Scendes mus subspicatus構(gòu)建了在水相系統(tǒng)中工作的氧電極系統(tǒng),發(fā)現(xiàn)除草劑非常敏感,與基于傳遞介質(zhì)的系統(tǒng)在長(zhǎng)時(shí)間的操作中具有更高的靈敏度。Detmar等[39]采用了萊茵衣藻 Chlamydomonas reinhardtii構(gòu)建了光纖 pH的生物檢測(cè)器,用來測(cè)定 pH值的變化,可用于環(huán)境中有毒化合物的早期監(jiān)控。Maria等[40]將月牙藻 Selenastrum細(xì)胞固定在 2%的瓊脂中,可以通過檢測(cè) pH的變化來測(cè)定重金屬 Cr6+的量。

4 展 望

目前,固定化技術(shù)已經(jīng)在污水處理、次生代謝物生產(chǎn)、種質(zhì)保藏、環(huán)境檢測(cè)、污水脫氮除磷、產(chǎn)生能源等方面展現(xiàn)出可喜的能力,借助微藻固定化技術(shù),有可能早日突破實(shí)現(xiàn)微藻生物電池因?yàn)槲⒃宓拿芏刃?、生長(zhǎng)持續(xù)時(shí)間短、體積大等缺點(diǎn)而未能投入實(shí)際應(yīng)用的瓶頸,服務(wù)于我們的社會(huì)。同時(shí)在固定的藻類細(xì)胞中,質(zhì)粒具有良好的穩(wěn)定性,可以降低突變的產(chǎn)生[41],使得微藻固定化技術(shù)應(yīng)用于分子生物學(xué)領(lǐng)域具有一定的前景。雖然,固定化微藻已用于實(shí)際的污水脫氮除磷,但是由于目前微藻固定化技術(shù)的不完善,受到固定化材料的造價(jià)較高、沒有開發(fā)出成型的固定化微藻傳感器等[42]因素限制,還不適用于大規(guī)模的廢水處理,其用于污水的生物處理和環(huán)境的生物監(jiān)測(cè)方面還處于試驗(yàn)室研究階段,有待于今后不斷地努力和技術(shù)的革新,將微藻固定化推向廣闊的應(yīng)用實(shí)踐中。

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R 943.1

A

167326575(2010)0620600204

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 (編號(hào):30970308),國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目(No:101069710)

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2010208225

2010210221)

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