孫益民，焦容容，孫若瓊，張繼紅

1(安徽省功能性分子固體重點實驗室，安徽蕪湖，241000) 2(安徽師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，安徽蕪湖，241000)3(安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽蕪湖，241000) 4(安徽師范大學(xué)環(huán)境科學(xué)學(xué)院，安徽蕪湖，241000)5(安徽省天然產(chǎn)物超臨界提取工程技術(shù)研究中心，安徽蕪湖，241007)

熊果酸(ursolic acid)是枇杷葉的有效成分之一，又名烏蘇酸、烏索酸，是多種植物的功能成分，具有抗炎抗菌、抗肝損傷［1－2］、抗氧化［3］、降血糖、降血脂、止咳等多種藥理活性［4］。近年來又發(fā)現(xiàn)熊果酸是很好的免疫增強劑［5］，具有較顯著的免疫和抗致癌作用。同時，熊果酸及其衍物還對病毒具有抑制活性，可望成為低毒、有效的新型抗癌和抗愛滋病毒藥物［6］。日本專利顯示熊果酸在抗癌保健食品、飲料和護(hù)發(fā)素、頭發(fā)生長劑等方面也有一定的應(yīng)用［7］?？梢?，熊果酸有著廣闊的應(yīng)用前景和十分重要的開發(fā)利用價值。

目前，對熊果酸提取多采用溶劑提取法。其特點是操作簡單，成本低廉。作者曾對超聲波輔助提取熊果酸進(jìn)行較為系統(tǒng)的研究，運用均勻設(shè)計法安排試驗［8－9］，以高效液相色譜測定熊果酸的含量，以提取率為試驗指標(biāo)，研究了乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間、提取次數(shù)、液固比及粒子大小5個因素對提取效果的影響。本文針對提取時間的影響進(jìn)行了重點研究。

均勻設(shè)計可以安排多因素多水平試驗，均勻試驗成功關(guān)鍵在于科學(xué)合理地建立試驗因素與試驗指標(biāo)間的定量關(guān)系，對實驗體系進(jìn)行描述，從而進(jìn)行工藝優(yōu)化［10］。本文應(yīng)用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)技術(shù)挖掘試驗信息，并進(jìn)行仿真指導(dǎo)驗證試驗，最終獲得了提取熊果酸的優(yōu)化工藝，為工業(yè)化生產(chǎn)提供可靠參考信息。

1 實驗部分

1.1 主要試劑與儀器

枇杷葉采自安徽蕪湖，經(jīng)鑒定為薔薇科植物枇杷Eriobotrya japonica(Thunb.)Lindl.的葉。無水乙醇(AR)，石油醚(AR、沸點60～90℃):國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;NaOH(AR):汕頭市西隴化工廠有限公司;熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品:安徽蕪湖甙爾塔醫(yī)藥科技有限公司。

FA1204電子天平，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司;WG-43電熱鼓風(fēng)干燥機，天津市泰斯特儀器有限公司;WF-111型高速中藥粉碎機，江陰市新友機械制造有限公司;TG328B分析天平，上海良平儀器儀表有限公司;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海振捷實驗設(shè)備有限公司;CQ-150超聲波清洗機，上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器械廠;美國Mode12000半制備色譜儀(配有Lab Alliance model 500可變波長紫外檢測器和Lab Alliance HPLC Workstation)，美國Science System公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 用超聲波法提取枇杷葉中熊果酸

將枇杷葉洗凈、去毛后放在干燥箱中烘干，冷卻至室溫后經(jīng)粉碎機粉碎，經(jīng)過分樣篩后備用。

稱取一定量的枇杷葉粉，超聲提取，趁熱過濾，濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，以石油醚萃取近無色，萃余物配成無水乙醇溶液，加入適量的稀NaOH溶液，調(diào)節(jié)pH值至10～11，靜置。再將所得濾液中加入適量稀HCl，調(diào)節(jié)pH值至2～3。然后加入一定量蒸餾水，離心分離，干燥即得熊果酸粗品。

1.2.2 高效液相色譜測定所得粗品中熊果酸的含量

1.2.2.1 色譜條件

色譜柱為Column型C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相為 V(甲醇)∶V(水)=97∶3;檢測波長:215 nm;流速0.8 mL/min;柱溫13℃。

1.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品5.3 mg置于10 mL容量瓶中，以甲醇定容，得到530 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。再依次稀釋得 106、21.2、10.6、5.3 μg/mL 熊果酸對照品溶液。分別準(zhǔn)確吸取熊果酸對照品溶液，在1.2.2.1色譜條件下進(jìn)樣20 μL進(jìn)行測定。其峰面積和濃度呈線性相關(guān)。回歸方程為Y=6 799+4 928X，r=0.999 999。

式中:Y為峰面積，X為濃度，r為相關(guān)因數(shù)。

說明當(dāng)熊果酸進(jìn)樣量在5.3～106 μg/mL時，線性關(guān)系良好。

1.2.2.3 原料溶液的制備

精密稱取干燥枇杷葉粉末5.049 6 g，加入30 mL甲醇超聲3次，每次30 min，合并提取液，過濾，甲醇定容至100 mL容量瓶，搖勻，取上清液，用孔徑為0.45 μm 的微孔濾膜過濾，進(jìn)樣量20 μL，采用高效液相色譜法分析，得原料中熊果酸含量為1.042%。

1.2.2.4 粗品溶液的制備

精密稱取一定量的熊果酸粗品，甲醇定容至50 mL容量瓶中，搖勻，取上清液，用孔徑為0.45 μm的微孔濾膜過濾，進(jìn)樣量20 μL，采用高效液相色譜法分析，歸一法測定粗品中熊果酸的含量，并分別計算出各個試驗的提取率。

2 結(jié)果與討論

2.1 均勻試驗設(shè)計與結(jié)果

取20g枇杷葉粉末，乙醇為溶劑，超聲提取。用均勻設(shè)計法考察了乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間、提取次數(shù)、液固比以及粒子大小對提取效果的影響。以提取率為試驗評價指標(biāo)，試驗安排與結(jié)果如表1所示。

從表1可以看出，均勻設(shè)計試驗的結(jié)果沒有整齊可比性，大多數(shù)文獻(xiàn)報道試驗結(jié)果通常用多因素多水平線性回歸分析或逐步回歸分析的方法來篩選變量，建立定量關(guān)系［11］。然而提取率與提取工藝條件之間是一種復(fù)雜非線性關(guān)系，提取條件間存在交互影響，如果工藝條件多結(jié)果分析很難做到科學(xué)合理。而人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)作為人工智能的一種計算工具，能夠有效地考察提取條件間的交互作用，具有強大的處理非線性問題的能力［12］。本文用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)技術(shù)研究試驗結(jié)果、分析系統(tǒng)規(guī)律。

表1 均勻設(shè)計試驗與結(jié)果

2.2 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建模

2.2.1 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的建立

對試驗數(shù)據(jù)采用3層的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)為5－3－1的誤差反向傳播模型(back-propagation，BP)建立描述熊果酸提取的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)辨識模型。網(wǎng)絡(luò)輸入層的節(jié)點數(shù)即為工藝中影響因素的數(shù)量，試驗為5個影響因素因此有5個輸入節(jié)點。網(wǎng)絡(luò)輸出層的節(jié)點數(shù)是試驗評價指標(biāo)即提取率指標(biāo)，亦即優(yōu)化工藝預(yù)報的對象。本工作的輸出節(jié)點數(shù)為1。為了保證模型的健壯性，本文中隱藏層的節(jié)點數(shù)經(jīng)過反復(fù)試驗計算，確定其數(shù)量為3，此數(shù)值較小建立的模型健壯性強。

2.2.2 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型參數(shù)的確定

BP網(wǎng)絡(luò)具有學(xué)習(xí)功能，每次以隨機抽取的8(=10－2)組試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行訓(xùn)練，其余2組試驗數(shù)據(jù)用作測試模型質(zhì)量，稱為“留二法”(leave-two-out)，在訓(xùn)練過程中可以根據(jù)計算誤差調(diào)整權(quán)重，當(dāng)誤差達(dá)到10－6時，記錄當(dāng)前權(quán)重值和偏置值，構(gòu)成模型網(wǎng)絡(luò)，訓(xùn)練次數(shù)為29次，訓(xùn)練誤差見圖1。網(wǎng)絡(luò)參數(shù)如表2、表3所示。

圖1 網(wǎng)絡(luò)模型訓(xùn)練誤差

表2 隱含層與輸入層的連接權(quán)重

表3 輸出層與隱含層的連接權(quán)重和偏置

圖2 模型計算值與試驗值比較

2.2.3 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的試驗驗證

為了檢驗人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建模結(jié)果的可靠性，用驗證試驗對人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型進(jìn)行驗證。

表4 驗證試驗值與計算值比較

表4給出了試驗測定值與神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)辨識值。圖2橫坐標(biāo)為神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)辨識值，縱坐標(biāo)為試驗測定值，各點越接近對角線就說明兩者誤差越小。如圖2所示，訓(xùn)練預(yù)報點和試驗點大部分散落在對角線附近，誤差較小，驗證了人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型系統(tǒng)辨識結(jié)果的可靠性。

2.3 提取熊果酸時間特性研究

為了使試驗更加符合實際情況，更快尋找出優(yōu)化工藝，采用多因素多水平鄰近分析的方法對枇杷葉中熊果酸的提取工藝進(jìn)行研究，即以均勻試驗的各組參數(shù)為基礎(chǔ)，利用已訓(xùn)練成功的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型對試驗點附近的參數(shù)組合進(jìn)行較為系統(tǒng)的研究。此種方法高度保持了均勻試驗設(shè)計的“均勻”特性，使得研究工藝范圍廣，研究范例具有均勻性、系統(tǒng)性。

由于需要系統(tǒng)研究的工藝范圍廣泛，涉及參數(shù)眾多，限于篇幅原因，本文論述的只是不同乙醇體積分?jǐn)?shù)條件下提取時間對產(chǎn)率影響。在相應(yīng)試驗工藝條件下研究其影響規(guī)律，通過神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型指導(dǎo)安排新的試驗。

2.3.1 試驗1與試驗2鄰近時間影響分析

圖3 液固比7∶1(g∶mL)，提取2次，粒子80目時不同乙醇體積分?jǐn)?shù)下提取時間對產(chǎn)率的影響

圖3 可以看出7條曲線的變化趨勢基本一致，隨著提取時間的延長，熊果酸提取率都為增長的趨勢。不同乙醇體積分?jǐn)?shù)條件下，提取時間的延長對產(chǎn)率影響不同。乙醇體積分?jǐn)?shù)在低濃度65%時，隨著提取時間的延長，產(chǎn)率增加幅度不大，時間延長到95 min時產(chǎn)率達(dá)到最大極限值94.98%。同時隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，產(chǎn)率達(dá)極限值需要的提取時間在縮短。乙醇體積分?jǐn)?shù)在較低濃度80%時，延長到75 min時產(chǎn)率達(dá)到最大極限值95%左右。在試驗1條件下，若提取時間小于60 min，則同一提取時間下，乙醇體積分?jǐn)?shù)越高，熊果酸提取率就越高。從提取時間-產(chǎn)率關(guān)系上分析，試驗1工藝時間特性屬于“加速型”，即延長提取時間產(chǎn)率的增長率提高。

圖4 液固比11∶1(g∶mL)，提取3次，粒子大小40目不同乙醇體積分?jǐn)?shù)下提取時間對產(chǎn)率的影響

由圖4可見，隨著提取時間的延長產(chǎn)率先減少后增加，減小的速度明顯比增加的速度快，并且增加的幅度很小，產(chǎn)品產(chǎn)率較低。提取時間的延長對低濃度乙醇條件下的產(chǎn)率影響較大。乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%時，隨著提取時間的延長產(chǎn)率變化很明顯，提取時間在60 min時產(chǎn)率大于90%，延長時間到90 min時產(chǎn)率10.18%，90 min后提取率緩慢上升。延長時間到90 min以上時乙醇體積分?jǐn)?shù)越高產(chǎn)率越高。從提取時間-產(chǎn)率關(guān)系上分析，試驗2工藝時間特性屬于“拋物線型”，即提取時間對產(chǎn)率的影響有極低值。

2.3.2 試驗3與試驗4鄰近時間影響分析

圖5 液固比4∶1(mL∶g)，提取2次，粒子大小40目時不同乙醇體積分?jǐn)?shù)下提取時間對產(chǎn)率的影響

圖5 中曲線變化趨勢基本一致，隨著提取時間的不斷延長，熊果酸的提取率不斷增大。在乙醇體積分?jǐn)?shù)較低的情況下，增加提取時間，產(chǎn)品產(chǎn)率的增加不明顯。這種趨勢在65%乙醇體積分?jǐn)?shù)下提取熊果酸表現(xiàn)的更為明顯，提取時間從60 min變化到110 min時，產(chǎn)率僅為最低極限0.086%。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的不斷增大，提取時間對產(chǎn)率的影響較為明顯，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到95%時，提取時間延長至80 min以后，提取率快速上升。從提取時間-產(chǎn)率關(guān)系上分析，試驗3工藝時間特性屬于“減速型”，即延長提取時間產(chǎn)率的增長率降低。

圖6 液固比8∶1，提取3次，粒子大小20目不同乙醇體積分?jǐn)?shù)下提取時間對產(chǎn)率的影響

從圖6可得到同樣的規(guī)律:隨著提取時間的延長，熊果酸的提取率不斷增大而且變化幅度比較大。不同乙醇體積分?jǐn)?shù)條件下要得到同樣產(chǎn)率的產(chǎn)品所需提取時間不同。乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%時，產(chǎn)率要高于40%至少要提取105 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)75%時需要95 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)90%時至多需要75 min。從提取時間-產(chǎn)率關(guān)系上分析，試驗4工藝時間特性與試驗3相同屬于“減速型”。

2.3.3 試驗5與試驗6鄰近時間影響分析

圖7 液固比12∶1，提取1次，粒子大小20目時不同乙醇體積分?jǐn)?shù)下提取時間對產(chǎn)率的影響

從圖7可見，提取時間的延長對熊果酸提取率的影響不同。乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%時，產(chǎn)率隨提取時間的增加而增加。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，產(chǎn)率隨提取時間的增加幅度不斷減小，最終出現(xiàn)不明顯的提取率降低趨勢。低乙醇體積分?jǐn)?shù)產(chǎn)率增加幅度大，提取時間從60～80 min的20 min內(nèi)65%乙醇產(chǎn)率提高0.29%/min，85%乙醇產(chǎn)率則提高0.09%/min。從提取時間-產(chǎn)率關(guān)系上分析，試驗5工藝時間特性亦屬于“減速型”。

圖8 液固比5∶1，提取3次，粒子大小80目時不同乙醇體積分?jǐn)?shù)下提取時間對產(chǎn)率的影響

圖8 中曲線變化的整體趨勢是延長提取時間有利于提高熊果酸提取率。若要得到產(chǎn)率在90%以上的產(chǎn)品，90%的乙醇中要提取95 min，80%的乙醇中則要提取110 min，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)降到70%時，提取120 min，僅得到不足85%的產(chǎn)率。從提取時間-產(chǎn)率關(guān)系上分析，試驗6工藝時間特性屬于“加速型”。

2.3.4 試驗7與試驗8鄰近時間影響分析

圖9 液固比9∶1，提取1次，粒子大小80目時不同乙醇體積分?jǐn)?shù)下提取時間對產(chǎn)率的影響

圖10 液固比13∶1，提取2次，粒子大小80目時不同乙醇體積分?jǐn)?shù)下提取時間對產(chǎn)率的影響

從圖9可見，延長提取時間并不利于熊果酸提取率的提高。較低乙醇體積分?jǐn)?shù)條件下，產(chǎn)率并沒有隨著提取時間的延長而變化;較高乙醇體積分?jǐn)?shù)條件下，產(chǎn)率隨著提取時間的延長反而在降低，下降的幅度較大。若提取時間從105 min延長到120 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%時，產(chǎn)率降低了近40%;乙醇體積分?jǐn)?shù)為85%時，產(chǎn)率降低了近25%。因此，在較低乙醇體積分?jǐn)?shù)條件下，105 min時就能得到高產(chǎn)率的產(chǎn)品。從提取時間-產(chǎn)率關(guān)系上分析，試驗7工藝時間特性為“衰減型”，即延長提取時間產(chǎn)率降低較快。

圖10可以看出延長提取時間有利于提高熊果酸提取率。不同乙醇體積分?jǐn)?shù)條件下，延長提取時間對熊果酸提取率影響不同。提取時間為25 min時，乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%的提取條件下，產(chǎn)率只有1.10%;乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%的產(chǎn)率為38.33%;乙醇體積分?jǐn)?shù)為95%的產(chǎn)率為87.05%;要得到高產(chǎn)率的產(chǎn)品，乙醇體積分?jǐn)?shù)為95%的提取條件下只需延長5 min即得到94.98%的產(chǎn)率，乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%的需延長20 min方可得到同產(chǎn)率產(chǎn)品，而乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%的則要延長30 min。從提取時間-產(chǎn)率關(guān)系上分析，試驗8工藝時間特性屬于“加速型”。

2.3.5 試驗9與試驗10鄰近時間影響分析

圖11 液固比6∶1，提取1次，粒子大小40目時不同乙醇體積分?jǐn)?shù)下提取時間對產(chǎn)率的影響

圖12 液固比10∶1，提取2次，粒子大小20目時不同乙醇體積分?jǐn)?shù)下提取時間對產(chǎn)率的影響

可以看出圖11中曲線的變化與圖4中曲線變化基本一致，隨著提取時間的延長產(chǎn)率先減少后增加，減小的速度明顯比增加的速度快，并且增加的幅度很小，較低乙醇體積分?jǐn)?shù)提取條件下產(chǎn)品產(chǎn)率低于其相應(yīng)的初始值。提取時間的延長對低濃度乙醇條件下的產(chǎn)率影響較大。乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%時，隨著提取時間的延長產(chǎn)率變化很明顯，提取時間在25 min時產(chǎn)率大于90%，延長時間產(chǎn)率降低，達(dá)到最低值后，時間的延長有利于產(chǎn)率的提高。從提取時間-產(chǎn)率關(guān)系上分析，試驗9工藝時間特性屬于“拋物線型”。

從圖12可見，曲線變化趨勢一致，延長提取時間有利于提高熊果酸的提取率。不同乙醇體積分?jǐn)?shù)條件下，提取時間的延長對熊果酸提取率的影響是不同的。乙醇體積分?jǐn)?shù)較低時，提取率隨時間的延長增加較快;乙醇體積分?jǐn)?shù)較高時，提取率隨提取時間的延長增加緩慢。提取相同的時間，乙醇體積分?jǐn)?shù)越高，熊果酸的提取率就越高。從提取時間-產(chǎn)率關(guān)系上分析，試驗10工藝時間特性與試驗3相同屬于“減速型”。

2.3.6 時間影響分析

圖13 對應(yīng)因子分析時間特性影響工藝分類

采用對應(yīng)因子分析方法［13］對10個試驗的時間特性進(jìn)行分析，可以發(fā)現(xiàn)其基本規(guī)律。對應(yīng)因子分析坐標(biāo) F1=6.321 944×10－2乙醇體積分?jǐn)?shù)(%)+7.569 224×10－2提取時間(min) －7.135 487×10－1液固比(mL/g)+9.362 540×10－2提取次數(shù) +5.111 274×10－2粒子大小(目)+6.882 883 ×10－1提取率(%)

F2=4.270 738×10－2乙醇體積分?jǐn)?shù)(%)－6.612 222×10－1提取時間(min)+3.991 259 ×10－1液固比( mL/g)－3.209 876×10－1提取次數(shù)－1.051 221×10－1粒子大小(目)+5.379 590 ×10－1提取率(%)

圖13中A、B、C、D和E分別依次表示乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間、液固比、提取次數(shù)和粒子大小。圖13可見。試驗1、6、8基本屬于一類，其時間特性為“加速型”，即隨著時間推移提取效率增率提高，且相近原因是粒子大小均為80目，導(dǎo)致“加速型”影響關(guān)系。試驗3、10相近由于提取時間相近，試驗4、5相近由于乙醇體積分?jǐn)?shù)和液固比原因，這4個試驗呈“減速型”特性，即隨著時間推移提取效率增率降低。試驗2、9劃為一類，呈現(xiàn)“拋物線型”，即隨著時間推移提取效率先降低再升高。7屬于另類，“衰減型”，即隨著時間推移提取效率降低。

3 工藝優(yōu)化

利用訓(xùn)練成功的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型優(yōu)化了枇杷葉中熊果酸提取工藝參數(shù)，結(jié)果如表6所示。

以產(chǎn)率高于90%為目標(biāo)優(yōu)化，提取時間間隔15 min，在考察各影響因素試驗范圍區(qū)間內(nèi)，共發(fā)現(xiàn)307組工藝組合，現(xiàn)列出其中的26組。

表6 產(chǎn)率在91%～99%產(chǎn)品生產(chǎn)工藝部分優(yōu)化結(jié)果(共307組，列出低濃度段26組供參考)

選取表6中的乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%，提取時間為15 min，液固比為10，提取次數(shù)為2，顆粒目數(shù)為40目，做試驗，產(chǎn)率為90.77%(模型計算為91.38%)。

4 結(jié)論

采用均勻設(shè)計法安排試驗，其特點研究因素多，研究水平數(shù)多，有利于系統(tǒng)研究。采用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)高度非線性分析技術(shù)能夠解決多因素多水平試驗結(jié)果建模問題。本文提出的多因素多水平鄰近分析方法將巨大量的試驗結(jié)果分析合理簡化，取得了很好的效果。其優(yōu)化的工藝經(jīng)過試驗驗證基本一致。

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