武 蕓

(生物資源保護與利用湖北省重點實驗室(湖北民族學(xué)院)，湖北 恩施 445000)

香樟(Cinnamomumcamphora)又名烏樟、芳樟、樟木等，為樟科樟屬常綠闊葉喬木，是我國熱帶、亞熱帶地區(qū)重要的用材、經(jīng)濟和生態(tài)樹種，為國家二級保護樹種[1],主要分布在我國的海南、臺灣、福建、江西、廣東、廣西、湖北、湖南、四川、重慶、云南、貴州、浙江等省市區(qū)[2].其木材材質(zhì)致密，有香氣，耐腐防蟲，為造船、家具和美術(shù)品的上等用材；其樹干、樹蔸、樹根及枝都含有樟油和樟腦，是重要的香料、農(nóng)藥、礦業(yè)、國防、化工等原料[3].

香樟在扦插和組織培養(yǎng)方面取得一些進展[4～10].采用種子繁殖，會積累大量變異性狀，不利于香樟優(yōu)良性狀的保留.但扦插繁殖受材料和季節(jié)限制，且繁殖系數(shù)低.利用香樟幼嫩帶芽莖段進誘導(dǎo)出了叢生芽，但誘導(dǎo)生根的成功率不高.因此，探索香樟快繁的新途徑很有意義.本次研究香樟愈傷組織的誘導(dǎo)和改良，為后續(xù)組織培養(yǎng)提供源頭和基礎(chǔ)，所得優(yōu)質(zhì)愈傷可通過器官發(fā)生途徑得到完整植株；可用于誘導(dǎo)多倍體，改良品種.

1 材料與方法

1.1 材料

香樟幼嫩的莖段來自湖北民族學(xué)院校園.

1.2 方法

1.2.1 材料的處理 選取初春香樟萌發(fā)的幼嫩莖段作為外植體，用1%的洗潔精浸泡15 min，用小毛刷自下而上順著涮洗4～5次，清洗掉殘留的洗潔精泡沫，自來水沖洗2～3 h后，在超凈工作臺上用75%的酒精中浸泡30 s左右，用0.1%的氯化汞(升汞)溶液振蕩消毒8～10 min(以升汞液面剛好浸沒外植體材料為宜)，用無菌水沖洗升汞殘留液3～4次，備用.

1.2.2 愈傷組織的誘導(dǎo) 以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，誘導(dǎo)愈傷組織的形成.將已消毒的外植體(保留腋芽的莖段)，切除藥液接觸過的傷口，剪成約1 cm長的小段，左右，接入到培養(yǎng)基中，使剪切過的橫截面?zhèn)冢瑴\淺的埋入到培養(yǎng)基中，以利于培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分和激素等細胞狀態(tài)調(diào)節(jié)因子在傷口附近的富集，注意外植體在培養(yǎng)基中的位置分布要均勻，成正多邊形，以利于充分利用培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì).光照時間12 h/d，光照強度為40 μmol·m-2·s-1，培養(yǎng)溫度23～25℃.30d后統(tǒng)計愈傷組織的的形成情況，計算其誘導(dǎo)率，并觀察所得愈傷組織的顏色和生長勢.誘導(dǎo)率=形成愈傷組織的外植體塊數(shù)/接種外植體的塊數(shù)×100%.

1.2.2.1 不同激素及其組合對愈傷組織的誘導(dǎo)效應(yīng) 以NAA、6-BA、2,4-D和KT不同質(zhì)量分數(shù)為單因子試驗，觀察它們對香樟的離體莖段的誘導(dǎo)效應(yīng)；根據(jù)單因子試驗結(jié)果,設(shè)置激素組合對愈傷組織誘導(dǎo)及生長的影響.

1.2.2.2 激素、pH和蔗糖質(zhì)量分數(shù)對愈傷組織的誘導(dǎo)效應(yīng) 采用正交試驗的方法，分析激素、pH和蔗糖質(zhì)量分數(shù)對愈傷組織的誘導(dǎo)效應(yīng).

1.2.2.3 愈傷組織的改良 通過減少MS基本培養(yǎng)基中硝酸鉀的含量，來降低銨態(tài)氮和硝態(tài)氮之間的比值，達到對愈傷組織進行改良的目的.分別配制減少硝酸鉀質(zhì)量分數(shù)的1/6、1/5、1/4、1/3的MS培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)接后培養(yǎng)15 d，觀察統(tǒng)計.

表1 NAA、6-BA、2,4-D和KT對香樟愈傷組織誘導(dǎo)率

注：-：死亡,+：生長勢差，++：生長勢一般，+++：生長勢較好，++++：生長旺盛，以下同上.

表2 不同激素組合對五鶴續(xù)斷愈傷組織的誘導(dǎo)效應(yīng)

2 結(jié)果與討論

2.1 不同植物激素對愈傷組織的誘導(dǎo)

研究NAA、6-BA、2,4-D和KT對香樟愈傷組織誘導(dǎo)的效應(yīng)，結(jié)果表明(見表1)：無論是誘導(dǎo)率還是在生長勢，2,4-D和KT比6-BA和NAA都具有更高的誘導(dǎo)活性.在添加2,4-D和KT的培養(yǎng)基中，外植體7d左右可觀察到莖段膨脹，切口處有明顯的分裂痕跡，而添加6-BA、NAA的培養(yǎng)基15d左右才觀察到愈傷組織有萌動的趨勢.可見，在單因子試驗中，2,4-D和KT適于誘導(dǎo)香樟愈傷組織，其質(zhì)量分數(shù)分別為1.5 mg/L和1.0 mg/L時誘導(dǎo)效率最高，生長勢較好.

2.2 不同植物激素組合對愈傷組織的誘導(dǎo)

在單因子試驗的基礎(chǔ)上,試驗了2,4-D+KT、2,4-D+6-BA以及2,4-D+NAA三種組合對愈傷組織誘導(dǎo)及生長的影響.結(jié)果顯示(見表2)，三種激素組合均可誘導(dǎo)出愈傷組織，2,4-D+KT誘導(dǎo)愈傷組織的效率較高，最高達到了88.7%，因此，誘導(dǎo)愈傷組織的最佳激素組合為2,4-D(1.5 mg/L)+KT(1.0 mg/L).

2.3 激素和蔗糖的質(zhì)量分數(shù)、PH對愈傷組織的誘導(dǎo)效應(yīng)

研究激素和蔗糖質(zhì)量分數(shù)以及PH對愈傷組織的誘導(dǎo)效應(yīng)，結(jié)果表明(見表3)：根據(jù)極差R的大小可知影響香樟愈傷組織的誘導(dǎo)因素中，2,4-D>KT>PH>蔗糖質(zhì)量分數(shù)，2,4-D影響最大，隨著2,4-D質(zhì)量分數(shù)增加，愈傷組織的誘導(dǎo)率升高，在質(zhì)量分數(shù)較低的范圍內(nèi)，2,4-D質(zhì)量分數(shù)跟香樟愈傷組織的誘導(dǎo)率呈正相關(guān)性；觀察表中B列的K值K3

2.4 愈傷組織的改良

試驗所得到的部分愈傷組織色澤暗淡枯黃，組織結(jié)構(gòu)膨化疏松，在繼續(xù)培養(yǎng)的過程中會萎謝，不具備進一步分化生長的能力，通過減少MS基本培養(yǎng)基中硝酸鉀的含量，來降低銨態(tài)氮和硝態(tài)氮之間的比值，達到對愈傷組織進行改良的目的.配制減少硝酸鉀質(zhì)量分數(shù)的1/6、1/5、1/4、1/3的MS培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)接后培養(yǎng)15 d，觀察統(tǒng)計.結(jié)果顯示，減少硝酸鉀1/6、1/5，達不到降低比例的要求，減少1/3，硝酸鉀含量偏低，影響愈傷組織的正常生長，減少1/4為最佳，所得的愈傷組織顏色呈淡綠色，質(zhì)地緊密，生長旺盛，細胞胚性強，可進一步誘導(dǎo)分化.

3 結(jié)論

通過激素和蔗糖質(zhì)量分數(shù)以及PH的正交實驗，得出誘導(dǎo)香樟離體莖段形成愈傷組織的優(yōu)化培養(yǎng)基為：MS+2,4-D(1.5 mg/L)+KT(1.0 mg/L)+20 g/L蔗糖,pH為6.0，愈傷組織誘導(dǎo)率可高達89.9%.對所得愈傷組織轉(zhuǎn)入到減少硝酸鉀含量1/4的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，其旺盛生長、結(jié)構(gòu)致密，可用于誘導(dǎo)分化.

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