龍 瀾,李亞杰,程新華,帥超群

(1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)創(chuàng)新中心鄂西綜合實(shí)驗(yàn)站，湖北 恩施 445000；2.恩施清江生物工程有限公司，湖北 恩施 445000)

艾葉屬菊科植物艾(ArtemisiaargyiLevl.et.Vant.)的干燥葉，具有散熱止痛，溫經(jīng)止血的作用.用于少腹冷痛，經(jīng)寒不調(diào)，宮冷不孕吐血等癥狀.異澤蘭黃素是艾葉中一種活性成分，二十世紀(jì)八十年代發(fā)現(xiàn)異澤蘭黃素能抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[1]，它還具有治療胃潰瘍和鎮(zhèn)痙的作用[2,3]，能調(diào)控血糖含量[4],還有抗誘變因素的小生能[5]，在臨床上治療胃癌有一定的療效.目前，異澤蘭黃素的檢測(cè)方法主要是液相色譜[6，7].筆者采用超聲波提取，反相高效液相色譜法檢測(cè)艾葉中異澤蘭黃素的含量.

1 儀器與試藥

Waters液相2996；KQ-250D型超聲波清洗器.異澤蘭黃素對(duì)照品(天津一方科技有限公司提供，批號(hào)20100601)，色譜乙腈，去離子水，甲醇、80%甲醇、無(wú)水乙醇、95%乙醇試劑均為分析純，艾葉樣品采自湖北恩施市內(nèi)野生品種，經(jīng)本研究所楊永康高級(jí)農(nóng)藝師鑒定為菊科植物ArtemisiaargyiLevl.et.Vant..

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Waters μBondapark C18柱(3.9 mm×300 mm，10 μm)，流動(dòng)相∶乙腈-磷酸緩沖鹽(40∶60)(稱取2.72 g磷酸二氫鉀溶于1 000 mL去離子水中，磷酸調(diào)pH=2.5～3.0)；流速:1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng):350 nm；柱溫:25℃.樣品中異澤蘭黃素與其他組分分離較好.

圖1 異澤蘭黃素對(duì)照品

圖2 艾葉樣品

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取異澤蘭黃素對(duì)照品5.0 mg，置50 mL棕色瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，作對(duì)照儲(chǔ)備液.取備用液,加乙腈配置成0.5，5，10， 20，30 μg/mL的對(duì)照品溶液.

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 提取液的選擇 取艾葉樣品過(guò)(4號(hào)篩)五份各約0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密稱定，分別精密加入甲醇、80%甲醇、無(wú)水乙醇、95%乙醇，超聲波提取45 min，測(cè)定.其結(jié)果顯示甲醇提取效果最好，且雜質(zhì)少，因此選甲醇為提取劑.

2.3.2 提取時(shí)間的選擇 取艾葉樣品(過(guò)4號(hào)篩)五份各約0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密稱定，加入甲醇50 mL，分別超聲波提取30、45、60、80 min，測(cè)定.結(jié)果顯示在45 min內(nèi)可提取完全，因此選提取時(shí)間為45 min.

表1 添加回收率實(shí)驗(yàn)

2.3.3 供試品溶液的制備 取艾葉樣品(過(guò)4號(hào)篩)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理45 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過(guò)濾，即得.

2.3.4 線性關(guān)系的考察 取對(duì)照品溶液,按照2.1的色譜條件,以異澤蘭黃素對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo),相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性方為:y=314 252x-192 374，r=0.999 91，結(jié)果表明異澤蘭黃素在0.5～3.0 μg/mL之間線性關(guān)系良好.

2.4 精密度試驗(yàn)

按照2.1的色譜條件連續(xù)進(jìn)同一供試品溶液5次，測(cè)定峰面積的RSD為1.86%.

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，按照2.1的色譜條件，每2 h測(cè)定一次，供試品中異澤蘭黃素含量的RSD為1.04%(n=7) ，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定.

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取艾葉樣品，按照2.3.2的方法進(jìn)行處理，平行制備5份，依法測(cè)定，計(jì)算其RSD為2.03%.

2.7 回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的同一艾葉樣品(含量約萬(wàn)分之6.47)約0.5 g，分別加入等量異澤蘭黃素對(duì)照品，按照2.3.2的方法進(jìn)行處理，測(cè)定含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1.

3 討論

1)在對(duì)異澤蘭黃提取溶劑的考察過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)甲醇的提取效果是最好的；并對(duì)超聲波提取時(shí)間進(jìn)行考察，結(jié)果采用超聲提取45 min為最佳方法.

2)通過(guò)對(duì)異澤蘭黃素的三維掃描，異澤蘭黃素的最大吸收在350 nm處.

3)本實(shí)驗(yàn)所建立的測(cè)定異澤蘭黃素含量的方法，準(zhǔn)確度高，操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、靈敏度高、重復(fù)性好，能準(zhǔn)確檢測(cè)艾葉中異澤蘭黃素的含量.

[1] Koshihara Y,Neichi T,Lee S D,et al.Selective inhibition of 5-lipoxygenase by natural compound isolated from Chinese plants[J].Artemisia rubripes Nakai,1983,158:41-48.

[2] Seo H J,Surh Y J.Eupatilin,a pharmacologically active flavone derived from Artemisia plants, induces apoptosis in human promyelocytic leukemia cells[J].Mutation Res,2001,496:191-206.

[3] Abu-Niaaj L,Aau-Iarga M,Abdalla S.Isolation and inhibitory effection of eupatilin,a flavone isolated from Artemisia monosperma del.,on raf isolated smooth muscle[J].Pharm Biol,1996,34:134-140.

[4] Kim S H, Lee S D,Kim W B,et al.Determination of a new antiulcer agent, eupatilin,in rat plasma,bile,urine,and liver homogenate by natural compounds isolated performance liquid chromatography[J].Chromatography,1997,97:165-171.

[5] Nakasugi T,Nakashima M,Komai K.Antimutagens in gaiyou (Artemisia argyi Lev1.et Vant)[J].J Agric Food Chem,2000,48:3 256-3 266.

[6] Lee H W, Ji H Y, Kim H H,et al.Determination of Eupatilin in Human Plasma by High-performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry[J].C hromatographia,2004,59:425-428.

[7] Lee Y W,Jin Y Z,Row K H,et al.Extraction and purification of eupatilin from Artemisia princeps PAMPAN recycling preparative HPLC[J].Korean J Chem Eng,2006,23(2):279-282.