王洪江，孫尚韶，宋 墨，姜 偉，李克軍，王忠裕

(大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 普外科， 遼寧 大連 116011)

近年來研究發(fā)現(xiàn)[1,2]乳腺癌發(fā)生、發(fā)展與機體的免疫狀態(tài)特別是樹突狀細胞的關(guān)系十分密切。樹突細胞表面的MHCⅠ、Ⅱ類分子、共刺激分子及免疫黏附分子低表達或不表達以及腫瘤細胞分泌的IL-10、TGF-β1、VEGF等免疫抑制因子可能是樹突細胞抗原提呈功能障礙，導(dǎo)致腫瘤細胞的免疫逃逸，加重腫瘤細胞浸潤及出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的原因之一。本實驗通過乳腺癌及其周圍組織中浸潤樹突狀細胞(tumor infiltration dentric cell，TIDC)及其表面分子表達的檢測，對乳腺癌患者局部免疫情況進行了研究。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 標(biāo)本采集：收集大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科2008年11月～2008年12月收治的乳腺癌病人26例，均為女性，年齡32～76歲，中位年齡51.1歲。所有患者術(shù)前均未經(jīng)放、化療，均行乳腺癌改良根治術(shù)，術(shù)后病理證實為浸潤性導(dǎo)管癌。標(biāo)本采集均在手術(shù)標(biāo)本離體30 min內(nèi)進行，每例患者均取腫瘤及癌旁正常腺體組織，標(biāo)本迅速置于-80℃冰箱中凍存。

1.1.2 實驗試劑：實驗中的免疫組化試劑，如鼠抗人CD1a單克隆抗體、鼠抗人CD83單克隆抗體、鼠抗人CD54單克隆抗體、兔抗人S-100蛋白單克隆抗體、SP試劑盒和DAS染色試劑盒、即用型快捷免疫組化MaxVisionTM試劑盒，均購于北京中杉生物技術(shù)開發(fā)有限公司；陽性對照由北京中杉生物技術(shù)開發(fā)有限公司提供的切片；陰性對照使用PBS代替一抗，購于北京中杉生物技術(shù)開發(fā)有限公司。TRIZOL Reagent、cDNA第一鏈合成逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、β-actin、IL-10、TGF-β1、VEGF A引物、100 bpDNA ladder marker均購于或由日本TaKaRa公司大連分公司合成。PCR擴增儀：美國MJResearch公司；壓電泳儀：EC Appotatus corporation；凝膠成像系統(tǒng)：Hema凝膠圖像分析系統(tǒng)(Gel-Pro Analyzer Version 3.0)。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)本處理：手術(shù)切取乳腺癌和癌周新鮮標(biāo)本,取其一部分經(jīng)10%甲醛固定,制成石蠟切片,行免疫組化染色;另一部分用于分離乳腺癌組織和癌周組織單細胞懸液，用于提取總RNA,采用RT-PCR方法從mRNA水平檢測乳腺癌細胞中IL-10、TGF-β1及VEGF-A基因的表達。

1.2.2 免疫組化染色及結(jié)果判定：乳腺癌及癌周標(biāo)本組織切片厚度為4 μm,常規(guī)脫蠟、水化后,3% H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶,檸檬酸緩沖液高溫高壓抗原修復(fù),按即用型快捷免疫組化MaxVisionTM試劑盒說明書操作。一抗采用鼠抗人S-100單克隆抗體,設(shè)陽性對照和陰性對照,以試劑盒中提供的陽性切片做陽性對照,以PBS代替一抗作為陰性對照。采用DAB染色,HE復(fù)染。S-100陽性樹突細胞以細漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色信號；CD1a陽性樹突細胞主要以細胞間質(zhì)和胞膜內(nèi)出現(xiàn)棕褐色信號；CD83陽性樹突細胞以細胞間質(zhì)和細胞膜內(nèi)出現(xiàn)棕黃色信號；CD54陽性樹突細胞主要以胞膜、胞漿出現(xiàn)明顯染色的細胞。腫瘤組織中的浸潤程度根據(jù)Furukawa等提出的分級標(biāo)準：在低倍鏡(×100，Olympus雙目顯微鏡) 下選取癌細胞密集區(qū)，更換高倍鏡(×400) ，計數(shù)10個高倍視野內(nèi)陽性細胞的總數(shù)，0～20個陽性細胞為陰性；>20個細胞為陽性表達。

1.2.3 乳腺癌組織中IL-10、TGF-β1、VEGF基因的檢測：從-80℃冰箱取出組織標(biāo)本，切取一小塊，約50 mg，提取RNA后，鑒定RNA純度，用RNA逆轉(zhuǎn)錄，合成第一鏈cDNA，以下列引物作為PCR的模版分別檢測乳腺癌及癌周組織中的IL-10、TGF-β1、VEGF mRNA，在凝膠成像系統(tǒng)紫外線燈下中，觀察PCR擴增產(chǎn)物條帶并記錄圖像。引物設(shè)計采用Primer 5和Oligo 6引物設(shè)計軟件設(shè)計，所有引物均由日本TaKaRa公司大連分公司合成，β-actin上游引物： 5’-GGGACCTGACTGACTACCTC-3’、β-actin下游引物：5’-ACTCGTCATACTCCTGCTTG-3’；IL-10上游引物：5’-TCAGGGTGGCGACTCTAT-3’、IL-10下游引物：5’-TGGGCTTCTTTCTAAATCGTTC-3’；TGF-β1上游引物：5’-CGGAGTTGTGCGGCAGTGGTTGAG-3’、TGF-β1下游引物：5’-GGCGCCCGGGTTATGCTGGTTGTA-3’；VEGF上游引物：5’-ATGGCAGAAGGAGGAGGG-3’、VEGF下游引物：5’-CGAACCCTGAGGGAGGCT-3’。RT-PCR結(jié)果判斷：β-actin產(chǎn)物長度為546 bp、IL-10產(chǎn)物長度為199 bp、TGF-β1產(chǎn)物長度為448 bp，VEGF產(chǎn)物長度為420 bp，PCR產(chǎn)物擴增條帶出現(xiàn)在目的條帶區(qū)，即判定為表達陽性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料比較采用卡方檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 乳腺癌及癌周組織中樹突狀細胞的表達情況

S-100+TIDC可見細漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色信號(圖1a)，乳腺癌組織中S-100+TIDC的浸潤數(shù)量明顯比對照癌旁組織數(shù)量減少；26例乳腺癌組織中S-100+TIDC的表達為4例，陽性率15.4%;癌旁組織中S-100+TIDC表達分別22例,陽性率84.6%，明顯高于乳腺癌組織(P<0.05)。

2.2 乳腺癌及癌周組織中樹突狀細胞的CD1a、 CD83及CD54的表達

觀察乳腺癌組織中樹突狀細胞表面分子的免疫組化染色可見細胞間質(zhì)和胞膜內(nèi)出現(xiàn)棕褐色的CD1a+TIDC(圖1b)、細胞間質(zhì)和細胞膜內(nèi)出現(xiàn)棕黃色CD83+TIDC(圖1c)和胞膜，胞漿出現(xiàn)明顯染色的CD54+TIDC(圖1d)。26例乳腺癌組織和癌旁組織的CD1a+TIDC、CD83+TIDC和CD54+TIDC的表達情況見表1。 癌旁組織的CD1a+TIDC、CD83+TIDC和CD54+TIDC的陽性表達明顯高于乳腺癌組織，其差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 乳腺癌組織中樹突狀細胞S-100、CD1a、 CD83及CD54的表達(×400)

CD1a陽性例數(shù)%CD83陽性例數(shù)%CD54陽性例數(shù)%乳腺癌組織519.2519.200癌旁組織2284.62180.81869.2

2.3 乳腺癌及癌周組織中免疫抑制因子IL-10 mRNA、TGF-β1 mRNA、VEGF A mRNA表達的檢測

26例乳腺癌組織和癌旁組織中均有β-actin的表達，陽性率為100%；IL-10 mRNA、 TGF-β1mRNA和VEGF A mRNA的表達見圖2、表2。乳腺癌組織中的IL-10 mRNA、TGF-β1mRNA、VEGF A mRNA表達陽性率均明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 免疫抑制因子的檢測由左至右條帶區(qū)單數(shù)為乳腺癌、雙數(shù)為癌旁組織、最右側(cè)為Maker帶

IL-10mRNA陽性例數(shù)%TGF-β1mRNA陽性例數(shù)%VEGFAmRNA陽性例數(shù)%乳腺癌組織2076.92076.91765.4癌旁組織726.9726.9311.5

3 討 論

樹突狀細胞是目前的功能最強的抗原提呈細胞[3]，具有捕獲、提呈抗原和致敏初始型T細胞的功能。成熟DC高表達MHC-Ⅰ、Ⅱ類分子和共刺激分子及黏附分子，具有較強的抗原提呈和激活初始型T細胞能力。其抗腫瘤機制是樹突狀細胞對腫瘤抗原的攝取，即攝取抗原后樹突狀細胞發(fā)育成熟，膜表面的MHC-Ⅰ、Ⅱ類分子和共刺激分子和黏附分子形成復(fù)合物，向T細胞內(nèi)傳遞信號，促進T細胞的激活。同時也可分泌大量的IL-12，誘導(dǎo)T細胞、自然殺傷細胞、淋巴因子激活殺傷細胞產(chǎn)生大量TNF-γ、穿孔素和顆粒酶，增強對靶細胞的溶解作用。因此，腫瘤組織中DC發(fā)揮抗原提呈功能受DC數(shù)量、表面分子的表達和免疫抑制因子等多種因素的影響。

文獻報告多數(shù)腫瘤組織中浸潤樹突狀細胞的數(shù)量和功能，與腫瘤生物行為和預(yù)后密切相關(guān)[4-6]。Kichles-lakomy等[7]發(fā)現(xiàn)早期乳腺癌患者體內(nèi)樹突狀細胞表達CDla、CD83、CD80、CD86、CD54明顯低于健康對照組，激活T淋巴細胞能力比健康對照組明顯減弱。李艷萍等[8，9]研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織腫瘤浸潤性DC主要集中于癌周和癌旁，癌灶內(nèi)的樹突狀細胞則分布較少，細胞形態(tài)不規(guī)則，表面可見長、短不等，粗細不一和數(shù)目不等的突起，其突起與癌細胞密切接觸，啟動抗腫瘤免疫。本實驗通過免疫組化染色對26例乳腺癌患者的癌組織和癌旁組織進行分析也有相似的結(jié)果：乳腺癌組織中樹突狀細胞的浸潤數(shù)量比癌旁組織數(shù)量明顯減少，乳腺癌組織中S-100+TIDC陽性率僅為15.4%;癌旁組織則高達84.6%，說明腫瘤組織中存在腫瘤浸潤性DC的數(shù)量減少，因此導(dǎo)致機體免疫功能低下，可能成為促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的原因之一。

TIDC可表達多種表面分子，主要包括CD1、CD4、CD33、CD44、CD80及主要組織相容性復(fù)合物-I、II類分子等。這些表面分子使DC能夠迅速地對微環(huán)境中的改變做出反應(yīng)，攝取各種各樣的免疫原性分子。此外，還需要其表面表達的共刺激分子、黏附分子的參與，才能完成抗原提呈能力。作者通過免疫組化方法對乳腺癌TIDC的表面分子及共刺激分子、黏附分子的表達進行了分析，結(jié)果表明，26例患者中有5例腫瘤組織中有CD1a+、CD83+TIDC的表達、且均不表達CD54+TIDC，提示TIDC是一種功能低下或無功能的DC，無法有效地識別和殺傷腫瘤細胞，可能是TIDC無法有效誘導(dǎo)抗原特異性CTL反應(yīng)的原因之一。

造成TIDC功能低下或無功能的原因，多數(shù)學(xué)者認為是腫瘤細胞釋放的免疫抑制因子作用于DC所致，導(dǎo)致其表面分子的表達和功能發(fā)生變化?；A(chǔ)研究表明，抑制浸潤樹突狀細胞的成熟和遷移的因子主要有IL-10、TGF-β1、VEGF、IL-12等，是可能造成浸潤樹突狀細胞表型異常及功能低下的原因之一。IL-10、VEGF及TGF-β1均為免疫抑制因子，能夠抑制抗原提呈細胞的免疫功能。Allavena等[10]研究表明IL-10能降低DC的表面分子如MHC-II、CD80及CD86等的表達率，抑制DC的分化成熟，抑制DC的抗原提呈能力。而IL-10的分泌又受TGF-β的影響，TGF-β的存在可明顯促進IL-10的分泌。應(yīng)用抗體阻斷法證實TGF-β對抗原提呈細胞功能的影響是通過IL-10實現(xiàn)的，而且TGF-β1可下調(diào)MHC-II類分子的表達。VEGF是一種重要的血管生成刺激因子，由腫瘤細胞釋放，抑制樹突狀細胞成熟，導(dǎo)致腫瘤逃避機體的免疫監(jiān)視。研究發(fā)現(xiàn)VEGF可在DC成熟過程的早期影響造血前體細胞分化為功能成熟的DC[11]。Mitsuhiko Iwamoto等[12]的研究認為，VEGF可以抑制CD34+前體細胞分化為功能成熟的DC,腫瘤浸潤性DC的數(shù)量與VEGF表達呈負相關(guān),VEGF在抑制腫瘤微環(huán)境中腫瘤浸潤性DC的成熟過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Iwanoto等[12，13]研究了130例乳腺癌患者浸潤樹突狀細胞，發(fā)現(xiàn)CD83+浸潤樹突狀細胞與長期不復(fù)發(fā)和生存率有顯著關(guān)系。并分析得出CD83+浸潤樹突狀細胞浸潤與VEGF的表達呈負相關(guān)，其結(jié)論在腫瘤內(nèi)有CD83+浸潤樹突狀細胞是調(diào)控腫瘤免疫的重要因素。Takahashi等研究了人類胃癌組織中浸潤樹突狀細胞與VEGF-C的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)樹突狀細胞在腫瘤中數(shù)量與VEGF-C的浸潤呈負相關(guān)。本研究結(jié)果顯示乳腺癌組織均有IL-10 mRNA、TGF-β1mRNA、VEGF A mRNA高水平的表達，而癌旁組織中表達水平很低或無表達，說明乳腺癌組織局部有多量的免疫抑制因子存在，這些免疫抑制因子單獨或聯(lián)合作用可能造成樹突狀細胞表面的MHCⅠⅡ類分子、共刺激分子、免疫黏附分子低表達或不表達的原因之一，從而降低樹突狀細胞抗原提呈功能，導(dǎo)致腫瘤細胞的免疫逃逸[12]。

因此，乳腺癌組織中浸潤性樹突狀細胞數(shù)量減少， IL-10、TGF-β1、VEGF等免疫抑制因子高表達以及乳腺癌中樹突狀細胞的MHC-Ⅱ類分子、黏附分子和共刺激分子等表面分子低表達或不表達，致使浸潤性樹突狀細胞的抗原提呈功能受抑制，使腫瘤細胞免疫逃逸。進一步研究腫瘤微環(huán)境中TIDC表型及功能狀態(tài)變化的原因，有助于深入認識腫瘤免疫逃逸機制。

[1] Maehara Y,Kabashima A.Recurrences and relation to tumor growth potential and local immune response in node-negative advanced gastric cancer[J].Oncology，1999,56(4):322-327.

[2] Ishigami S,Aikou T.Prognostic value of HLA-DR expression and dendritic cell infiltration in gastric cancer[J].Oncology,1998,55(1):65-69.

[3] Engleman EG.Dendritic cell-based cancer immunotherapy[J].Sermin Oncol,2003,30:23-29.

[4] Cai XY,Gao Q,Qiu SJ,et al.Dendritic cell infiltration and prognosis of human hepatocellular carcinoma[J].J Cancer Res Clin Oncol,2006,19:1-9.

[5] Hillenbrand EE,Neville AM,Coverntry BJ.immunohistochemical localization of CD1a-positive putative dendritic cells in human breast tumors[J].Br J cancer,1999,79(5-6):940-944.

[6] Coventry BJ,Morton J.CD1a-positive infiltrating dendritic cell density and 5-year survival from human breast cancer[J].Br J Cancer,2003,89(3):533-538.

[7] Kichler-Lakomy C,Budinsky AC,Wolfram R,et al.Deficiences in phenotype expression and function of dentritic cells from patients with early breast cancer[J].Eur J Med Res,2006,11(1):7-12.

[8] 李艷萍,史福軍,李強,等.樹突狀細胞標(biāo)志分子在人乳腺癌中的表達及與T細胞的關(guān)系[J].解剖學(xué)報，2006,37(1)：91-95.

[9] 李艷萍,路軍秀,李強,等.樹突狀細胞在乳腺癌組織中的表達[J].新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2006,23(1):11-13.

[10] Allavena P,Piemonti L,Longoni D，et al.IL-10 prevents the differentiation of monocytes to dendritic cells but promotes their maturation to macrophages[J].Eur J Immunol,1998,28:359-369.

[11] Oyama T,Ran S,Ishida T,et al.Vascular endothelial growth factor affects dendritic cell maturation through the inhibition of nuclear factor-kappa B activation in hemopoietic progenitor cells[J].J Immunol,1998，160:1224-1232.

[12] Mitsuhiko Iwamoto,Hisashi Shiohara.Prognostic value of tumor-infiltrating dendritic cells expression CD83 in human breast carcinoma[J].Int J Cancer,2003,104:92-97.

[13] Tsukayama S,Omura K,Yoshida K,et al.Prognostic value of CD83-positive mature dendritic cells and their relation to vascular endothelial growth factor in advanced human gastric cancer[J].Oncol Rep，2005,14(2):369-375.

數(shù)字的表達方式

執(zhí)行GB/T 15835-1995《出版物上數(shù)字用法的規(guī)定》。公歷世紀、年代、年、月、日、時刻和計數(shù)、計量均用阿拉伯?dāng)?shù)字。數(shù)字≥4位數(shù)時，每三位一組，組間空1/4個漢字空，如：“51,200”應(yīng)寫成“51 200”。但序數(shù)詞和年份、頁數(shù)、部隊番號、儀表型號、標(biāo)準號不分節(jié)。百分數(shù)的范圍和偏差，前一個數(shù)字的百分符號不能省略，如：5%～95%，不能寫成5～95%，(31.8±0.6)%，不能寫成31.8±0.6%。附帶尺寸單位的數(shù)值相乘，按下列方式寫成：4 cm×3 cm×5 cm，不能寫成4×3×5 cm3。