王 芳 于愛蓮 喬云波 謝繪玲 于廣福 莊東明

(1.泰山醫(yī)學院病原學教研室，山東 泰安 271000； 2.濟南市婦幼保健院，山東 濟南 251001；3.泰安市婦幼保健院，山東 泰安 271000)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染是一個嚴重的社會健康問題，我國是HBV感染的高發(fā)區(qū)，絕大多數(shù)乙型肝炎病毒感染始于兒童時期，其中約30%～50%為母嬰傳播所致[1]。生命早期感染HBV不僅易造成慢性攜帶狀態(tài)而且是肝硬化和肝癌的高危因素[2]。新生兒接種乙型肝炎疫苗和乙肝免疫球蛋白(hepatitis B immunoglobulin，HBIG)安全有效，可以明顯降低人群HBV慢性感染率，使高危新生兒HBV感染率由90%降至14%，但仍有10%～20%的高危兒不能得到乙肝疫苗的保護，即免疫失敗[3]。有多種因素導致免疫失敗，宮內(nèi)感染是免疫失敗的主要原因[4]。本研究通過檢測外周血T細胞亞群百分比變化，探討宮內(nèi)感染HBV嬰幼兒乙肝疫苗免疫失敗的機制，為制訂和完善乙肝免疫策略提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對象

2006年10月～2008年2月期間，在濟南市婦幼保健院分娩的，出生后被診斷為HBV宮內(nèi)感染的新生兒。宮內(nèi)感染診斷標準[5]：出生后檢測臍血，臍血中乙肝HBsAg、HBeAg、HBV-DNA任一陽性者診斷為宮內(nèi)感染。新生兒出生后主被動聯(lián)合免疫，即0，1，6個月各注射酵母型乙肝疫苗5 μg，24小時內(nèi)和出生后2周內(nèi)加用HBIG 100 IU，隨訪至1歲，符合上述標準，且家長同意參加者納入研究。有下列情況之一即可排除[6]：嚴重營養(yǎng)不良、腎臟疾病、糖尿病、先天畸形，傳染病急性期，合并巨細胞病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、EB病毒感染。研究對象分為免疫失敗組和免疫成功組。免疫失敗組：20例(男11例，女9例)，出生時外周臍血HBsAg陽性，以后持續(xù)HBsAg陽性，抗HBs陰性；免疫成功組：29例(男15例，女14例)，出生時HBsAg陽性，1歲內(nèi)HBsAg轉(zhuǎn)陰并以后持續(xù)陰性，抗-HBs陽性。兩組研究對象的年齡、身高、體重、性別組成和喂養(yǎng)方式差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2 主要試劑和儀器

CD3、CD4和CD8的鼠抗人抗體(cytognos sl)；質(zhì)控品為淋巴細胞凍干(CyTOTROL)，流式細胞儀(美國BD FACScalibur)；酶標儀(Bio-Rad，美國)。

1.3 T細胞亞群檢測

T細胞亞群檢測的具體過程按試劑盒說明書專人操作。共設2管，管1(CD3+-PE-Cy5，CD4+-FITC, CD8+-PE)，管2為空白對照。每管加入50 μl k2EDTA新鮮抗凝血，4 ℃避光孵育20 min，每管加溶血素1 ml，離心后棄上清，加入PBS重懸細胞混勻后上機檢測。根據(jù)前向散射光和側(cè)向散射光以淋巴細胞群設門，分別測定免疫成功組和免疫失敗組外周血中的CD3+、CD4+和CD8+細胞占T細胞百分率。

1.4 數(shù)據(jù)獲取與統(tǒng)計分析

2 結(jié) 果

2.1 免疫成功組與免疫失敗組嬰幼兒的臨床資料比較

通過兩組嬰幼兒的身高、體重、性別、喂養(yǎng)方式等基本臨床資料進行比較，結(jié)果顯示兩組嬰幼兒基本臨床資料差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2 免疫成功組與失敗組嬰幼兒外周血T細胞亞群比較

通過流式細胞儀檢測29例免疫成功與20例免疫失敗嬰幼兒的全血，測得兩組嬰幼兒外周血T細胞亞群百分比(圖1，表1)。結(jié)果提示，免疫失敗組與免疫成功組相比，CD3+T細胞百分比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；CD4+T細胞百分比降低，CD8+T細胞百分比升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；CD4+/CD8+比值免疫失敗組低于免疫成功組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

圖1 流式細胞儀檢測外周血T細胞亞群

(A)根據(jù)前向散射光和側(cè)向散射光設R1門圈出淋巴細胞(R1)，在R1門的基礎上圈定CD4+T細胞為CD3+CD4+細胞，CD8+T細胞為CD3+CD8+細胞。

表1 兩組嬰幼兒T細胞亞群比較

3 討 論

宮內(nèi)感染是HBV母嬰傳播的重要途徑，也是導致嬰兒出生后乙肝疫苗接種失敗的主要原因[6]。Hsu等[7]研究5年內(nèi)共22例乙肝疫苗接種失敗的新生兒，其中63.7%(14/22)發(fā)生宮內(nèi)感染。Lazizi等[8]研究發(fā)現(xiàn)乙肝疫苗接種失敗的宮內(nèi)感染兒對活病毒脊髓灰質(zhì)炎疫苗蛋白抗原、破傷風類毒素、肺炎多糖抗原可產(chǎn)生正常的體液免疫反應，可以排除繼發(fā)性免疫損傷機制。Tang等[9]認為宮內(nèi)感染兒出生前暴露于HBV抗原，對其產(chǎn)生免疫耐受，而對乙肝疫苗無反應。有報道應用IL-12和HBV抗原共同刺激時，能夠激發(fā)和增強病人外周血單核細胞的增殖以及干擾素的產(chǎn)生[10]，提示宮內(nèi)感染免疫失敗的兒童并不是完全的免疫耐受，對免疫失敗者實施多次免疫的方法，可以打破免疫耐受，提高抗-HBs陽轉(zhuǎn)率，有效保護易感人群。

新生兒階段是一個特殊的時期，大量的資料證實此階段T細胞功能呈現(xiàn)生理性低下狀態(tài)，故產(chǎn)生各種細胞因子的能力普遍不足， 尤以Th1類細胞因子水平低下更顯著，呈現(xiàn)低水平的Th2優(yōu)勢狀態(tài)， 此為胚胎期免疫發(fā)育特性的延續(xù)[11]，即某種抗原致敏的新生兒， 其細胞因子譜向Th2表型偏移[12]。當新生兒感染HBV時，Th1/Th2的平衡打破，與新生兒成長的免疫能力密切相關作用的Th1細胞分泌的細胞因子的抗病毒等細胞免疫反應水平低下，病毒清除無力，病毒感染遷延不愈，易致慢性化。

輔助性T細胞、CD4+T細胞在調(diào)節(jié)細胞免疫和體液免疫中起關鍵作用。 經(jīng)多年研究[13]，根據(jù)免疫效應階段產(chǎn)生細胞因子和生物活性的差別，可將CD4+T細胞分為Th0、Th1、Th2。Th1主要輔助細胞毒細胞發(fā)揮殺傷作用，增強細胞免疫應答，Th2主要輔助B細胞產(chǎn)生高滴度抗體，促進體液免疫反應。有研究發(fā)現(xiàn)[14]宮內(nèi)感染組新生兒CD4+T淋巴細胞百分比低于未感染組,而CD8+T淋巴細胞百分比高于未感染組。本研究采用流式細胞術觀察宮內(nèi)感染嬰幼兒乙型肝炎疫苗接種后免疫成功組和免疫失敗組外周血T亞群百分比變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，免疫失敗組外周血中CD4+百分比和CD4+/CD8+比值顯著低于免疫成功組，而外周血中CD8+百分比免疫失敗組顯著高于免疫成功組。

因此, 在孕期積極治療、新生兒聯(lián)合免疫的同時, 考慮采用高效安全的抗病毒藥物、細胞因子及免疫調(diào)節(jié)劑, 阻斷母嬰傳播, 破壞乙肝病毒的特異性免疫耐受，提高機體細胞免疫功能( Th1細胞因子水平) 是控制乙肝病毒感染的研究方向,同時應對免疫方面的異常機制進行進一步深入的研究。

[1] 崔恒春,閆永平,邵中軍,等. 免疫預防后HBeAg與HBV宮內(nèi)感染分析[J].中國公共衛(wèi)生,2006,22 (7) :824-826.

[2] Michielsen P P, Damme P.Viral hepatitis and pregnancy[J].Acta Gastroenterol Belg,1999,62(1):21-29.

[3] 王素萍,徐德忠.乙型肝炎病毒宮內(nèi)感染的研究現(xiàn)狀及今后工作重點[J].中華流行病學雜志,2005, 26 (4): 229-231.

[4] SELIMB,TAMINAL,MUBARRENU,et al.Transplacental passage of hepatitis B antigen negative mothers and delayed immune response in newboms [J]. Infect Dis,1994,169(3):704-709.

[5] 秦天云，周筠. 乙型肝炎病毒宮內(nèi)感染兒免疫效果觀察[J].內(nèi)蒙古醫(yī)學雜志, 2007, 39 (3):345-346.

[6] Huang K，Lin S．Nationwide vaccination：A success in Taiwan [J]．Vaccine,2000, 18 (1) : 35-38.

[7] Hsu H Y, Chang M H, Ni Y H,et al. Surface gene mutants of HBV in infants who develop acute or chronic infections despite immunoprophylaxis[J]. Hepatology,1997,26(2):786-791.

[8] Lazizi Y, Badur S, Perk Y,et al. Selective unresponsiveness to HBsAg vaccine in newborns related with an inutero passage of hepatitis B virus DNA[J]. Vaccine,1997,15(10):1095-1100.

[9] Tang S L, Hsu H Y, Lin H H,et al. Hepatitis B surface anti-genemia at birth, a long-term follow-up [J]. J Pediatr,1998,133 (3):374-377.

[10] Schlaak JF,Tully G,Lohr HF,et al.The presence of high amounts of HBV-DNA in serum is associated with suppressed costimulatory effects of interleukin-12 on HBV-induced immune response[J].J Hepatol,1999,30:353-358.

[11] Delespesse G.Maturation of human neonatal CD4+T lymphocytes into Th1 /Th2effectors[J].Vaccine, 1998, 16: 1415.

[12] Marshall-Clarke S, Reen D, Tasker L, et al.Neonalal immunity: how well has it grown up[J]? Immunol Today, 2000, 21: 3.

[13] 黃 星, 蔣艷敏. 乙肝病毒宮內(nèi)感染與臍血Th1/Th2細胞亞群體外活化的研究[J].中國婦幼保健, 2007,22(10): 1398-1399.

[14] 杜二球, 鄭九生.新生兒HBV宮內(nèi)感染臍血T淋巴細胞亞群的特點[J] .江西醫(yī)學院學報,2009,2:55-57.