張維秋,潘渭涓,陳 祥,耿士忠,黃金林,潘志明,焦新安

(揚(yáng)州大學(xué)江蘇省人獸共患病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇揚(yáng)州 225009)

禽源大腸埃希菌質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類(lèi)藥物耐藥基因的檢測(cè)*

張維秋,潘渭涓,陳 祥,耿士忠,黃金林,潘志明,焦新安*

(揚(yáng)州大學(xué)江蘇省人獸共患病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇揚(yáng)州 225009)

從我國(guó)部分地區(qū)病、死家禽中分離到大腸埃希菌403株。按照CLSI(clinical and laboratory standards institute)推薦的K-B藥敏紙片法對(duì)其中的344株分離株進(jìn)行藥敏紙片試驗(yàn);根據(jù)GenBank上發(fā)表的序列,設(shè)計(jì)并合成了五對(duì)引物,對(duì)所有分離細(xì)菌進(jìn)行質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類(lèi)藥物耐藥基因的擴(kuò)增:qnrA、qnrB、qnrS、aac(6′)-ib-cr和qepA。1993年-1996年禽源大腸埃希菌分離株僅對(duì)萘啶酸的耐藥率超過(guò)60%;2001年-2008年禽源大腸埃希菌分離株對(duì)1-3代7種喹諾酮類(lèi)藥物的耐藥率均超過(guò)58%。在403株禽源大腸埃希菌中共檢出3(0.7%)株qnrB陽(yáng)性菌株,2(0.5%)株qnrS陽(yáng)性菌株,5(1.2%)株aac(6′)-ib-cr陽(yáng)性菌株以及5(1.2%)株qepA陽(yáng)性菌株,未檢測(cè)到qnrA陽(yáng)性菌株。結(jié)果顯示,近20年來(lái),我國(guó)禽源大腸埃希菌對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物的耐藥性不斷上升,同時(shí),質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類(lèi)藥物耐藥基因在禽源大腸埃希菌中呈不斷上升的流行趨勢(shì)。

禽;大腸埃希菌;喹諾酮耐藥性;質(zhì)粒介導(dǎo)

長(zhǎng)期以來(lái),以治療、預(yù)防疾病和促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)為目的,不合理使用抗生素,導(dǎo)致抗生素過(guò)度使用或?yàn)E用,在抗生素的選擇性壓力下,大腸埃希菌耐藥性不斷上升,這已成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]。喹諾酮類(lèi)藥物在臨床上是我國(guó)治療禽大腸埃希菌病的常規(guī)用藥之一,而對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物的不合理使用導(dǎo)致了細(xì)菌耐藥性的增加以及耐藥譜的變化,細(xì)菌對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物的耐藥機(jī)制過(guò)去普遍認(rèn)為主要為染色體基因突變,而不存在水平傳播的可轉(zhuǎn)移基因。近年來(lái)開(kāi)始出現(xiàn)一些新的喹諾酮類(lèi)藥物耐藥基因位于細(xì)菌質(zhì)粒上,使得喹諾酮類(lèi)藥物耐藥性在人獸共患病原菌間的迅速擴(kuò)散成為可能,嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康。

1998年,Martinez-M artinez L等[2]發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類(lèi)藥物耐藥基因 qnr(現(xiàn)命名為qnrA),其編碼蛋白與Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶特異性結(jié)合,導(dǎo)致細(xì)菌耐藥。近年來(lái),qnrB[3],qnrS[4],aac(6′)-Ib-cr[5],qepA[6]等新型質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類(lèi)藥物耐藥基因陸續(xù)被報(bào)道證實(shí)。質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類(lèi)藥物耐藥機(jī)制補(bǔ)充了傳統(tǒng)的細(xì)菌對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物的耐藥途徑,使得耐藥的形式多樣化。

本研究通過(guò)藥敏紙片法分析我國(guó)禽源大腸埃希菌對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物的耐藥性變化,同時(shí)通過(guò)PCR檢測(cè)質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類(lèi)藥物耐藥(PMQR)基因,了解PMQR在禽源大腸埃希菌中的流行情況。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源和培養(yǎng)條件 1993年-2009年從江蘇、上海等18個(gè)省、市、自治區(qū)收集具有大腸埃希菌病變的禽肝臟、脾臟、卵巢等作病料。大腸埃希菌病料直接劃線接種于麥康凱平板,37℃培養(yǎng)18 h,挑取典型菌落在麥康凱平板上分區(qū)劃線,37℃培養(yǎng)18 h后挑取單個(gè)典型菌落純培養(yǎng)后凍干保存,共分離并保存403株禽源大腸埃希菌。qnrA,qnrB,qnrS陽(yáng)性菌株由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院蔣琰博士惠贈(zèng);qepA陽(yáng)性質(zhì)粒由日本國(guó)家傳染病控制中心Yamane K教授惠贈(zèng);aac(6′)-ib-cr陽(yáng)性菌株由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。質(zhì)控菌:大腸埃希菌ATCC25922,金黃色葡萄球菌ATCC25923由本室保存。

1.1.2 主要試劑 8種抗生素藥敏紙片:萘啶酸(Nalicixic acid,NA),依諾沙星(Enoxacin,ENX),諾氟沙星(Norfloxacin,NOR),氧氟沙星(Ofloxacin,OFL),氟諾沙星(Fleroxacin,FLX),環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin,CIP),洛美沙星(Lomefloxacin,LM L),加替沙星(Gatifloxacin,GAT),均購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司;麥康凱干粉培養(yǎng)基、水解酪蛋白瓊脂(MH)等試劑為杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品;DNA marker,DNA polym erase,FokⅠ購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;dNTP購(gòu)自Promega公司;其他常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)產(chǎn)品。

1.2 藥敏紙片試驗(yàn)

按CLSI推薦的Kirby-Bauer法進(jìn)行[7],對(duì)1993年-2008年分離的344株大腸埃希菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn),參照CLSI手冊(cè)中藥物敏感性標(biāo)準(zhǔn)作出結(jié)果判斷。

1.3 質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類(lèi)藥物耐藥(PMQR)基因的檢測(cè)

1.3.1 PMQR基因引物設(shè)計(jì) 根據(jù)文獻(xiàn)及Gen-Bank中已發(fā)表的序列,分別設(shè)計(jì)出針對(duì) qnrA、qnrB、qnrS、aac(6′)-ib 和 qepA 的 5對(duì)特異性引物(引物序列見(jiàn)表1),對(duì)403株大腸埃希菌分離株進(jìn)行檢測(cè)。

表1 PCR引物序列Tab le 1 The sequences of prim ers for PCR

1.3.2 PCR擴(kuò)增 細(xì)菌DNA模板的制備按全菌裂解法進(jìn)行[10],qnr的PCR反應(yīng)參數(shù)為94℃預(yù)變性3m in,94℃變性30 S,57℃退火30 S,72℃延伸40 S,共進(jìn)行30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸7 min,4℃保存,aac(6′)-ib和qepA的退火溫度為60℃。對(duì)于aac(6′)-ib基因陽(yáng)性的菌株,PCR產(chǎn)物回收后通過(guò)FokⅠ酶切鑒定,變異體不存在此酶切位點(diǎn),而野生型能被酶切。所有陽(yáng)性菌株P(guān)CR產(chǎn)物送上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 禽源大腸埃希菌藥敏紙片試驗(yàn)結(jié)果

在8種喹諾酮類(lèi)藥物中,大腸埃希菌對(duì)第一代喹諾酮類(lèi)藥物萘啶酸的耐藥率最高(76.5%),對(duì)第四代喹諾酮類(lèi)藥物耐藥率最低(19.8%)。耐藥率低于50%的有諾氟沙星(40.4%)、氧氟沙星(38.7%)、環(huán)丙沙星(44.8%)(表 2)。1993 年-1996年大腸埃希菌分離株耐藥率超過(guò)60%的僅有萘啶酸(61.6%),對(duì)其余7種藥物耐藥率均低于50%,其中有三種藥物的耐藥率低于20%,分別為諾氟沙星(19.2%)、氧氟沙星(18.1%)、加替沙星(10.7%)。1997年-2000年大腸埃希菌分離株對(duì)氟諾沙星(63.3%)和洛美沙星(60.0%)2種抗生素的耐藥率超過(guò)60%;2001年-2004年大腸埃希菌分離株對(duì)除加替沙星外的7種抗生素耐藥均超過(guò)66.7%,對(duì)萘啶酸的耐藥率達(dá)到97.7%。2005年-2008年間的大腸埃希菌雖然對(duì)前三代喹諾酮的耐藥率相較2001年-2004年稍有下降,但是仍然保持一個(gè)很高的耐藥率(表2)。

表2 禽源大腸埃希菌藥敏紙片試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The result of antimicrobial sensitivity test of avian E.coli isolatesby usingthe Kirby-Bauer method

2.2 質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類(lèi)藥物耐藥基因的檢測(cè)結(jié)果

在403株禽源大腸埃希菌中共檢測(cè)到qnrB陽(yáng)性菌株3株,qnrS陽(yáng)性菌株2株,aac(6′)-ib-cr陽(yáng)性菌株5株,qepA陽(yáng)性菌株5株,分別占菌株總數(shù)的0.7%,0.5%,1.5%,1.5%。陽(yáng)性對(duì)照株擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果見(jiàn)圖1,PMQR基因陽(yáng)性菌株背景材料見(jiàn)表3。

圖1 陽(yáng)性對(duì)照株P(guān)CR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Agarose gelelectrophoresis of PCR products of positive strains

表3 質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類(lèi)藥物耐藥基因陽(yáng)性菌株的背景資料Table 3 Characteristics of plasm id-mediated quinolone resistance strains

2.3 DNA測(cè)序結(jié)果

根據(jù)National Center for Biotechnology In formation(NCBI)中的BLASTn檢索結(jié)果顯示,陽(yáng)性菌株所攜帶的喹諾酮類(lèi)質(zhì)粒耐藥基因序列與網(wǎng)上公布的序列一致。

3 討論

近年來(lái),隨著喹諾酮類(lèi)藥物的大量使用甚至濫用,大腸埃希菌對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物耐藥率不斷上升。本研究結(jié)果顯示,從上世紀(jì)90年代起禽源大腸埃希菌對(duì)喹諾酮類(lèi)部分抗生素耐藥性已經(jīng)較強(qiáng),近十幾年來(lái)大腸埃希菌分離株對(duì)大部分氟喹諾酮類(lèi)抗生素耐藥性提高了兩倍以上。值得注意的是2005年-2008年分離株相較2001年-2004年雖然對(duì)1到3代喹諾酮類(lèi)藥物的耐藥性稍有下降,但仍然維持了一個(gè)很高的水平,這種變化可能在一定程度上歸因于新藥的推廣以及近幾年對(duì)這些一到三代喹諾酮類(lèi)藥物使用的逐漸減少,但是由于藥物之間的交叉耐藥性以及新出現(xiàn)的質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類(lèi)藥物耐藥基因在細(xì)菌之間的水平傳播,細(xì)菌的耐藥率仍然維持在很高的水平上;而大腸埃希菌分離株對(duì)加替沙星這種2002年在中國(guó)新上市的第四代氟喹諾酮類(lèi)藥物的耐藥率則一直呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì),由之前的10.7%上升到36.0%。

近年來(lái),對(duì)細(xì)菌喹諾酮類(lèi)藥物的耐藥機(jī)理研究有了新的發(fā)現(xiàn),過(guò)去認(rèn)為喹諾酮類(lèi)藥物的耐藥性是由細(xì)菌染色體變異引起的,但新近研究表明質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類(lèi)藥物耐藥性也是其耐藥機(jī)制的重要組成部分。

質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥(PMQR)于1987年孟加拉國(guó)一場(chǎng)Ⅰ型痢疾志賀氏菌爆發(fā)中首次發(fā)現(xiàn)[12],與PMQR相關(guān)的基因命名為qnr[13]。本研究對(duì)1993年至2009年間分離的403株大腸埃希菌進(jìn)行檢測(cè),共檢測(cè)到3株qnrB陽(yáng)性菌株,2株qnrS陽(yáng)性菌株;aac(6′)-ib-cr是氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶的變異基因,其本質(zhì)上是一種氨基糖甙類(lèi)乙酰轉(zhuǎn)移酶基因aac(6′)-ib的變異體,故只能乙?；坞x氨基的喹諾酮類(lèi),本研究中通過(guò)PCR和酶切鑒定共檢測(cè)到5(1.2%)株aac(6′)-ib-cr基因陽(yáng)性菌株,其中 4株細(xì)菌分離于2008年,1株分離于2009年;耐藥基因qepA通過(guò)調(diào)控外排泵相關(guān)基因從而引起細(xì)菌對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物耐藥水平的變化,本研究中共檢測(cè)到qepA陽(yáng)性細(xì)菌5株,陽(yáng)性率為1.2%,這其中4株陽(yáng)性菌株來(lái)自同一大型養(yǎng)殖場(chǎng),除1株對(duì)加替沙星中敏外,5株細(xì)菌對(duì)八種喹諾酮類(lèi)藥物都表現(xiàn)出高度耐藥。

值得注意的是,2008年共檢測(cè)大腸埃希菌46株,其中1株細(xì)菌為qn rB陽(yáng)性,4株aac(6′)-ib-cr陽(yáng)性,PMQR基因的檢出率為10.9%;而在2009年,共檢測(cè)細(xì)菌31株,其中2株為qnrB、2株qnrS和1株aac(6′)-ib-cr陽(yáng)性細(xì)菌,PMQR基因的檢出率為16.1%。近幾年來(lái),PMQR基因在禽源大腸埃希菌中有不斷上升的流行趨勢(shì)。

以上結(jié)果顯示,近20年來(lái),我國(guó)禽源大腸埃希菌對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物的耐藥性不斷增強(qiáng),已成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。雖然qnr、qepA和 aac(6′)-ib-cr僅介導(dǎo)低水平的喹諾酮類(lèi)藥物耐藥性,但它們的存在有助于選擇出高水平的喹諾酮類(lèi)藥物耐藥性[14]。一般認(rèn)為低水平耐藥性可使細(xì)菌數(shù)量達(dá)到出現(xiàn)突變所需的濃度,從而出現(xiàn)高度耐藥。質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥基因,不僅可垂直傳給子代,更重要的是可在不同微生物間進(jìn)行水平傳播,加快喹諾酮類(lèi)藥物耐藥性在細(xì)菌間的傳播。因此非常有必要在我國(guó)開(kāi)展質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮類(lèi)藥物耐藥性的調(diào)查研究和耐藥機(jī)制研究,監(jiān)測(cè)PMQR基因的流行情況,合理使用抗生素,以期減少喹諾酮類(lèi)藥物耐藥菌的產(chǎn)生、人獸共患病原菌間耐藥性的傳遞并為藥物的開(kāi)發(fā)和臨床合理使用提供理論依據(jù)。

[1] 王曉泉,焦新安,陳祥,等.江蘇部分地區(qū)食源性和人源沙門(mén)氏菌的多重耐藥性研究[J].微生物學(xué)報(bào),2007,47(2):221-227

[2] Martinez-Martinez L,Pascual A,Jacoby G A.Quinolone resistance from a transferable plasm id[J].Lancet,1998,351:797-799.

[3] Jacoby G A,w alsh K E,M ills D M,et al.QnrB,an other plasm id-mediated gene for quinolone resistance[J].Antim icrob Agen ts Chemother,2006,50:1178-1182.

[4] Hata M,Suzuki M,Matsumoto M,et al.Cloning of a novel gene for qunoloine resistance from a transferable plasm id inShigella f lexneri2b[J].An tim icrob Agents Chemother,2005,49:801-803.

[5] Park C H,Robicsek A,Jacoby G A,et al.Prevalence in the U-nited States of aac(6')-Ib-cr encoding a ciprofloxacin-modifying enzyme[J].An tim icrob Agents Chemother,2006,50:3953-3955.

[6] Yamane K,W achino J,Suzuki S,et al.New plasm id-m ediated fluoroquinolone efflux pump,QepA,found in anEscher ichia coliclin ical isolates[J].An tim icrob Agents Chem other,2007,51:3354-3360.

[7] Clinical and Laboratory Standards Institu te/CLSI.Performance standards for antim icrobial susceptibility testing;Nineteenth informational supplement.CLSIdocument M 100-S19[J].Clin-i caland Laboratory Standard s Institute,W aynet Pennsylvania,2009,28(1):1-134.

[8] Cattoir V,Poirel L,Rotim i V,et al.M ultiplex PCR for detection of plasm id-m ediated quinolone resistance qn r genes in ESBL-producing enterobacterial isolates[J].Antim icrob Agents Chemother,2007,60:394-397.

[9] YamaneK,W achino J,SuzukiS,et al.Plasmid-mediated qepA gene amongEscher ich ia coliclinical isolates from Japan[J].Antim icrob Agen ts Chemother,2008,52:1564-1566.

[10] Sambrook J,Russell DW.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].3版.黃培堂,譯.北京:科學(xué)出版社,2002.

[11] Guerra B,Junker E,Schroeter A,et al.Phenotypic and genoty pic characterization of antim icrobial resistance in GermanEscherichia coliisolates from cattle,sw ine and pou ltry[J].J Antim icrob Chemoth,2003,52:489-492.

[12] Munshi M H,Sack D A,H aider K,et al.Plasm id-m ediated resistance to nalidix ic acid inShigella dysenteriaetype 1[J].Lan cet,1987,2:419-421.

[13] T ran JH,Jacoby G A.Mechan ism of plasm id-m ediated quinolone resistance[J].Proc Natl Acad SciUSA,2002,99:5638-5642.

[14] 劉健華,陳杖榴.喹諾酮類(lèi)抗菌藥耐藥新機(jī)制[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志,2007,43(1):54-56.

Detection of Plasm id-mediated Quinolone Resistance amongEscherchia colifrom Avian in China

ZHANGWe-iqiu,PAN We-i juan,CHEN Xiang,JIAO Xin-an

(Jiangsu Key Laboratory of Zoonosis,Yangzhou University,Yangzhou,Jiangsu,225009,China)

A totalof 403E.colifield isolates were derived from clinically affected chickens in 18 provincesof China between 1993 and 2009.Of which 344E.coliisolates from 1990s were carried out to 8 quinoloneant-i m icrobial sensitivity test by using the K irby-Bauer method recomm ended by CLSI(clinical and laboratory standards institute).A ll of the isolates were detected for the presence of qnrA,qnrB,qnrS,aac(6′)-ib-cr and qepA by PCR and sequencing.E.coliisolates from 1993-1996 had a resistancemore than 60%only to Nalicixic acid(61.6%),w hereas isolates from 2001-2008 had a resistancem ore than 58%to 7 antibiotics.Among the403E.coliisolates from China,qnrB,qnrS,aac(6′)-ib-cr and qepA were detected in 3(0.7%),2(0.5%),5(1.2%),and 5(1.2%)isolates,respectively,no qnrA positive isolatew as detected in this study.The results showed that the resistance ofE.colito quinolone agents had been increasing in the past twenty years and therewas a rising prevalence ofE.coliisolates harboring plasm id-mediated quinolone resistance genes in China.

avian;Escherchia coli;quinolone resistance;p lasm id m ediation

S854.43

A

1007-5038(2010)04-0074-05

2010-03-24

江蘇省自然科學(xué)基金(BK2008011);江蘇省高校自然科學(xué)研究項(xiàng)目(09KJB230002);江蘇省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題(K07016)

張維秋(1986-),女,山東臨沂人,碩士研究生,主要從事細(xì)菌耐藥方面的研究。*通訊作者

經(jīng)驗(yàn)交流