司 宏，徐艷艷(江蘇省南通市腫瘤醫(yī)院，南通 226361)

姜黃素(curcumin，Cur)是從姜科植物姜黃中提取的酚性有效單體化合物，有抗氧化、抗突變、抗促癌、抗炎等廣泛的藥理作用。姜黃素在抗腫瘤方面有顯著作用［1-4］，其主要通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而起到抗腫瘤作用。環(huán)氧化酶-2(COX-2)在正常組織中一般不表達(dá)，但在炎癥、生長(zhǎng)因子、腫瘤刺激物等誘導(dǎo)下可以迅速合成，多種腫瘤組織和癌前病變中COX-2表達(dá)均增。本研究以人胃癌SGC7901細(xì)胞為研究對(duì)象，探討姜黃素抑制人胃腺癌細(xì)胞增殖對(duì)COX-2基因及蛋白表達(dá)的影響。

1 材料

人胃癌細(xì)胞SGC7901株(上海玉博生物技術(shù)有限公司)，姜黃素按文獻(xiàn)［5］方法實(shí)驗(yàn)室自制。小鼠抗人COX-2單克隆抗體(IgG)(Cayman公司)，β-actin單抗(晶美公司)，HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗(晶美公司)。MTT和 RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司，胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物公司，胰酶購(gòu)自Biological Industries公司。主要儀器包括美國(guó)Forma Scientific公司的二氧化碳培養(yǎng)箱、日本 Olympus倒置顯微鏡、美國(guó)BECKMAN COULTER公司全自動(dòng)酶標(biāo)儀(DTX880UV)等。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

胃癌SGC7901細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，置37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，常規(guī)胰蛋白酶消化法傳代培養(yǎng)。

2.2 姜黃素對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞增殖的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC7901細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105·mL-1，接種于 96 孔板，每孔 90 μL，置 37℃ ，5%CO2，飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h，顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁。分別加入不同濃度的姜黃素10μL，使姜黃素在細(xì)胞的終濃度分別為5、10、20、40 和 80 μg·mL-1，每一濃度均設(shè) 5 個(gè)平行孔，陰性對(duì)照組加入等體積溶劑，置37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng) 24、48、72 h 后，每孔加入 12.07 nmol·L-1的 MTT 20 μL，37℃ 孵育 30 min，再加入 DMSO 150 μL/孔，終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm波長(zhǎng)處吸光度(OD值)，各組取3孔OD值的均數(shù)，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，按公式計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率(%)=(試驗(yàn)孔OD均值/對(duì)照孔OD均值)×100%。

2.3 姜黃素對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞COX-2 mRNA表達(dá)的影響

2.3.1 mRNA的提取:收集經(jīng)藥物處理72 h的細(xì)胞，胰酶消化后轉(zhuǎn)移至EP管內(nèi)，1 000轉(zhuǎn)/min離心10 min，棄去上清，用PBS洗1次，加1 mL Trizol混勻室溫放置10 min，加0.2 mL氯仿，震蕩 15 s，室溫靜置 2 min，12 000 r·min-1離心 10 min，棄去上清，加75%乙醇洗滌，7 500 r·min-1離心5 min，棄去上清室溫晾干，加30 μL DEPC水溶解。經(jīng)1.5%瓊脂糖上電泳鑒定RNA完整性，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2 RT-PCR:引物參考文獻(xiàn)［6］COX-2 引物序列為正義:5′-CAA GTC CCT GAG CAT CTA CG-3′，反義:5′-CAT TCC TAC CAC CAG CAA CC-3(487 bp)。β-actin引物序列為正義:5′-GGC ATC GTG ATG GAC TCC G-3′，反義:5′-GCT GGA AGG TGG ACA GCG A-3′(642 bp)。PCR 循環(huán)參數(shù)為 COX-2:95℃預(yù)變性 30 s;56.5℃ 退火 30 S，72℃ 延伸 30 s，35個(gè)循環(huán)后72℃延伸 10 min.β-actin:95℃ 預(yù)變性 30 S;65℃ 退火 30 S72℃ 延伸 30 S，27個(gè)循環(huán)后 72℃延伸 10 min。PCR產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察。應(yīng)用掃描儀掃描條帶，以β-actin作為對(duì)照，兩者光密度比值作為蛋白半定量相對(duì)值。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 Western-blotting考察姜黃素對(duì) SGC7901細(xì)胞 COX-2蛋白表達(dá)的影響

收集經(jīng)藥物處理72 h的細(xì)胞，冰預(yù)冷 PBS洗2次，加人100 μL細(xì)胞裂解液提取蛋白。以10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白(125 g)，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜后，依次加小鼠抗人COX-2單抗和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗孵育，ECL顯色。以β-actin作為對(duì)照，X光片灰密度比值作為蛋白半定量相對(duì)值。試驗(yàn)重復(fù)3次。

3 結(jié)果

3.1 系列濃度的姜黃素對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞增殖的影響

在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，隨著劑量增大，對(duì)細(xì)胞的抑制率增強(qiáng)，隨時(shí)時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞的抑制率也增強(qiáng)。姜黃素 5 μg·mL-1時(shí)細(xì)胞存活為(94.5 ± 4.1)% ，80 μg·mL-1時(shí)細(xì)胞存活率降至(55.8±2.2)%，見圖1。

圖1 系列濃度的姜黃素對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞增殖的影響Fig 1 Effects of a different concentration of curcumin on the proliferation of gastric cancer cell line SGC-7901

3.2 姜黃素對(duì)SGC7901細(xì)胞COX-2 mRNA表達(dá)的影響

各組細(xì)胞RT-PCR電泳照片見圖2，與陰性對(duì)照相比，姜黃素對(duì)SGC7901細(xì)胞COX-2 mRNA有抑制作用，抑制作用呈劑量依賴性，光密度比值見圖3。與陰性對(duì)照相比，姜黃素5 μg·mL-1組的 COX-2 mRNA表達(dá)沒有顯著差異(P＞0.05)，10 μg·mL-1組表達(dá)有所下降(0.05 ＞ P ＞ 0.01)，20 μg·mL-1、40 μg·mL-1和 80 μg·mL-1組 COX-2 mRNA的表達(dá)顯著下降(P＜0.01)。

3.3 姜黃素對(duì)SGC7901細(xì)胞COX-2蛋白表達(dá)的影響

Western-blotting結(jié)果顯示不同濃度姜黃素對(duì)SGC7901細(xì)胞COX-2蛋白表達(dá)有明顯的抑制作用，隨著姜黃素濃度的增加，抑制作用逐漸增強(qiáng)，見圖4。與陰性對(duì)照組相比，姜黃素5 μg·mL-1、10 μg·mL-1組的 COX-2 蛋白表達(dá)有所下降(0.05 ＞P ＞ 0.01)，20 μg·mL-1、40 μg·mL-1和 80 μg·mL-1組表達(dá)顯著下降(P＜0.01)。

4 討論

環(huán)氧酶(COX)是花生四烯酸生物合成前列腺素的合成酶，包括COX-1和COX-2。其中COX-2在正常組織中一般不表達(dá)，但在炎癥、生長(zhǎng)因子、腫瘤刺激物等誘導(dǎo)下可以迅速合成，多種腫瘤組織和癌前病變中 COX-2表達(dá)均增［7-9］。COX-2腫瘤促進(jìn)作用的機(jī)制雖不十分明確，但多認(rèn)為與 PG合成增加、抑制凋亡、促進(jìn)新生血管生成以及增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲性和介導(dǎo)致癌原產(chǎn)生有關(guān)［10，11］。流行病學(xué)研究表明，非甾體類抗炎藥(NSAIDs)可降低大腸癌、胃癌等消化道腫瘤的發(fā)病率，這與其能夠抑制腫瘤組織中COX-2和(或)PGE的表達(dá)有關(guān)。因此，通過(guò)抑制COX-2的表達(dá)以達(dá)到抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展就變得十分有意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可明顯減少體外培養(yǎng)高表達(dá)COX-2蛋白的胃癌SGC-7901細(xì)胞的數(shù)量，抑制細(xì)胞增殖，該作用呈明顯的濃度依賴性。5個(gè)不同濃度的姜黃素對(duì)COX-2 mRNA和蛋白的表達(dá)均有抑制作用，在低濃度時(shí)(5 μg·mL-1)這種抑制作用不明顯(P ＞0.05)，在較高濃度(20 ～80 μg·mL-1)時(shí)，抑制作用更加明顯(P＜0.01)。這些提示姜黃素對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞的抑制作用與COX-2途徑有關(guān)，具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

姜黃素不僅具有顯著的體內(nèi)外抗腫瘤活性，而且毒性很低，價(jià)格低廉，是一種很有開發(fā)前景的天然化合物。有研究表明，姜黃素對(duì)COX-2陽(yáng)性表達(dá)肺腺癌和胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用要強(qiáng)于COX-2陰性表達(dá)癌細(xì)胞，對(duì)胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS的COX-2轉(zhuǎn)錄和活性有抑制作用［6，12］，提示姜黃素對(duì) COX-2表達(dá)抑制作用在其抑癌作用機(jī)制中發(fā)揮重要作用。姜黃素對(duì)胃癌細(xì)胞COX-2表達(dá)抑制作用的影響，使之有可能成為天然的腫瘤信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)治療藥物或先導(dǎo)藥物，最終開發(fā)出高效，低毒的新型抗癌藥。

圖2 經(jīng)姜黃素處理72h后對(duì)SGC7901細(xì)胞COX-2 mRNA的影響Fig 2 Expression of COX-2 mRNA in SGC7901 cells after treatment with curcumin for 72 hours

圖3 各組細(xì)胞COX-2RT-PCR產(chǎn)物光密度比值Fig 3 Optical density ratio of COX-2RT-PCR products of each group of cells

圖4 各組細(xì)胞COX-2/β-actin灰密度比值Fig 4 Neutral density ratio of COX-2/β-actin of each group of cells

［1］ 余美榮，蔣福升，丁志山.姜黃素的研究進(jìn)展［J］.中草藥，2009，40(5):828.

［2］ 汪?；?，成 揚(yáng).姜黃素藥理作用的研究進(jìn)展［J］.上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，21(6):73.

［3］ 張麗娟，陸 茵.姜黃素抗腫瘤機(jī)制研究進(jìn)展［J］.中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2008，15(4):100.

［4］ Costello RT，Rey J，F(xiàn)auriat C，el al.New approaches in the immunotherapy of haematological malignancies［J］.Eur J Haematol，2003，70(5):333.

［5］ Uehara SL，Yasuda I，Akiyama K，et al.Diarylheptanoid from the rhizomes of carcuma xanthorriza and alpinia officinarum［J］.Chem Pharm Bull，1987，35(8):3298.

［6］ 劉 華，沈迎春，郭傳勇.姜黃素對(duì)胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS環(huán)氧合酶-2轉(zhuǎn)錄和活性的影響［J］.同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2008，29(5):23.

［7］ Bemis DL，Capodice JL，Anastasiadis AG，etal.Zyflamend，a unique herbal preparation with nonselective COX inhibitory activity，induces apoptosis of prostate cancer cells that lack COX-2 expression［J］.Nutr Cancer，2005，52(2):202.

［8］ Kang HK，Lee E，Pyo H，et al.Cyclooxygenaseindependent down-regulation of multidrug resistancassociated protein-1 expression by celecoxib in human lung cancer cells［J］.Mol Cancer Ther，2005，4(9):1358.

［9］ Kim SJ，SeoJH，LeeYJ，etal.Autocrine vascular endothelial growth factor/ascular endothelial growth factor receptor-2 growth pathway represents a cyclooxygenase-2-independent target for the cyclooxygenase-2 inhibitor NS-398 in colon cancer cells ［J］.Oncology，2005，68(23):204.

［10］ Yoshimoto T，Takahashi Y，Kinoshita T，et al.Growth stimulation and epidermal growth factor receptor induction in cyclooxygenase-overexpressing human colon carcinoma cells［J］.Adv Exp Med Biol，2002，507:403.

［11］ Sun YJ，TangXM，HalfE，etal.Cyclooxygenase-2 overexpression reduces apoptotic susceptibility by inhibiting the cytochrome c-dependent apoptotic pathway in human colon cancer cells［J］.Cancer Res，2002，62(21):6323.

［12］ Lev-Ari S，Starr A，Vexler A，et al.Inhibition of pancreatic and lung adenocarcinoma cell survival by curcumin is associated with increased apoptosis，Down-regulation of COX-2 and EGFR and inhibition of Erkl/2 activity［J］.Anticancer Res，2O06，26(6B):4423.