李 楊，張學(xué)凱，趙宗江，楊美娟(1.解放軍第309醫(yī)院腎內(nèi)科，北京 100091;.北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 10001)

慢性腎衰竭(chronic renal failure，CRF)是目前嚴(yán)重危害人類健康的多發(fā)病和常見病，腎臟纖維化(包括腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化)是各種腎臟疾病進入終末期的進行性、不可逆的共同病理損害［1］，對于尋找腎臟纖維化的各種治療措施是當(dāng)前腎臟病研究領(lǐng)域的重點與熱點。各種中成藥在臨床慢性腎衰竭治療應(yīng)用廣泛［2］，且療效顯著，而其具體作用機制并不明了。在研究中，觀察海昆腎喜對于慢性腎衰竭模型大鼠的腎臟保護作用，并初步探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

雄性Wistar健康大鼠45只，6周齡，清潔級，體重(200±20)g，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所 (SCXR京:200520013)。海昆腎喜膠囊，吉林輝南長龍生化藥業(yè)股份有限公司提供(批號:20030052);腺嘌呤，購自北京化學(xué)試劑公司，用前加蒸餾水配成20 mg·mL-1的混懸液。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組:成年Wistar雄性大鼠45只，購進后飼以普通飼料觀察1周，一般狀態(tài)良好后按體重隨機分組。正常對照組15只;模型組15只:給予腺嘌呤懸濁液灌胃200 mg·kg-1·d-1;海昆治療組15只:腺嘌呤懸濁液灌胃200 mg·kg-1·d-1，同時給予海昆腎喜溶液 200 mg·kg-1·d-1灌胃。以上各組大鼠給予普通飼料喂養(yǎng)，自由飲食活動。

1.2.2 取材方法:于每周末將實驗動物稱重、入代謝籠，留取24 h尿、測定尿蛋白。第4周末處死，按40 mg·kg-1體重水合氯醛腹腔注射麻醉后，用取血10 mL應(yīng)用自動分析儀測定血肌酐、尿素氮。開腹取出左側(cè)腎臟，用0.9%氯化鈉注射液沖洗后，分離腎皮質(zhì)，固定于10%中性甲醛溶液。

1.2.3 HE染色方法:切片脫蠟，梯度酒精進水，自來水沖洗;Harris氏蘇木素浸泡10～20 min，自來水沖洗;1%鹽酸酒精分化，自來水沖洗;1%伊紅浸泡10 min，自來水沖洗;梯度酒精脫水，二甲苯透明，環(huán)氧樹脂封片。

1.2.4 免疫組化染色:(1)石蠟切片常規(guī)脫蠟入水;(2)過氧化氫-甲醇孵育20 min以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性;(3)抗原修復(fù):微波修復(fù)90℃ ～98℃ 20 min;(4)正常山羊血清室溫封閉20 min;(5)加入一抗(1∶200)，4℃過夜;(6)加入生物素標(biāo)記的二抗，37℃孵育30 min;(7)加入 SABC，37℃下孵育30 min;(8)DAB室溫下顯色5 min;(9)升梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。陰性對照，一抗用代替。在200倍光鏡下檢測隨機切片10個不重疊視野，應(yīng)用ICMIAS病理圖像分析系統(tǒng)，計算每個視野陽性染色面積和整個視野面積的比值，并進行統(tǒng)計分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS 11.5軟件包進行數(shù)據(jù)分析，所有計量數(shù)據(jù)以(±s)表示，差異顯著性檢驗采用單因素方差分析，組間差異比較用Q檢驗，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般狀況及存活情況

正常對照組大鼠在整個實驗周期中表現(xiàn)機警、反應(yīng)快，皮毛致密而有光澤，生長、進食及活動情況均無明顯異常。模型組大鼠從第2周起已經(jīng)出現(xiàn)明顯的精神萎靡，活動遲緩，皮毛脫落、無光澤。與模型組相比，治療組大鼠出現(xiàn)上述癥狀的時間有不同程度的延遲。

2.2 各組大鼠體重的變化

隨著喂養(yǎng)時間的延長，正常對照組大鼠體重逐漸增加，而模型組大鼠體重逐漸減輕，模型組大鼠體重明顯低于正常對照組(P＜0.05)，其中第4周顯著差異(P＜0.01);海昆治療組大鼠體重較同期CRF模型組普遍偏高，其中第4周時，兩組間體重有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，見表1。

2.3 各組大鼠尿蛋白的變化

造模大鼠給予腺嘌呤灌胃2周后，大鼠出現(xiàn)明顯的蛋白尿，與正常對照組比較，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01);而海昆治療組大鼠24 h尿蛋白排泄較模型組明顯減少，在第4周末更明顯(P ＜0.01)，見表1。

2.4 各組大鼠腎功能的變化

造模各組大鼠血肌酐、尿素氮水平較正常對照組均明顯升高(P＜0.01)，但治療組大鼠與模型組相比，血肌酐水平無明顯差異(P＞0.05)，見表2。

2.5 病理學(xué)變化

肉眼觀察正常組大鼠腎臟大小正常，被膜光滑，不易剝脫，褐色、有光澤。模型組大鼠腎臟腫脹，體積增大，質(zhì)地松軟，呈灰白色，缺乏光澤，包膜易剝脫，皮髓質(zhì)界限不清，為典型的“大白腎”。海昆治療組大鼠腎臟腫脹，體積較模型組小，質(zhì)地稍松軟，表面呈淺紅色，不光滑，缺乏光澤，皮髓質(zhì)界限清晰，被膜結(jié)合緊，不易剝脫。

光鏡下觀察各組大鼠腎組織HE染色切片，正常對照組動物腎臟皮髓質(zhì)分界清晰，腎小球數(shù)目正常，腎小管上皮完好，腎間質(zhì)未見炎癥細胞浸潤及纖維化;模型組動物腎小球數(shù)目明顯減少，殘存的腎小球囊腔擴張，包曼氏囊壁增厚，近曲小管渾濁腫脹，遠曲小管和集合管擴張，腔內(nèi)可見大量金黃色腺嘌呤結(jié)晶、蛋白管型、細胞管型，腎間質(zhì)纖維化，大量炎細胞浸潤。治療組病理變化均較模型組減輕，腎小管中度擴張，腎小管內(nèi)見少量金黃色結(jié)晶，輕度間質(zhì)纖維化。

表1 各組大鼠每周體重及24 h尿蛋白變化Tab 1 Body weight and 24-hour urine protein level of each group at each week

表2 各組大鼠血清肌酐、尿素氮變化Tab 2 Change in serum creatinine and UN levels in each group

2.6 各組大鼠腎組織CTGF蛋白的表達

在200倍光鏡下觀察切片，正常組大鼠腎組織中腎小管上皮細胞、腎間質(zhì)細胞及腎小球系膜細胞胞漿中有CTGF蛋白少量的表達;模型組與正常組相比較，腎小管上皮細胞和腎間質(zhì)細胞中CTGF蛋白強陽性表達，也有一些腎小球系膜細胞胞漿內(nèi)CTGF蛋白表達上調(diào);治療組CTGF蛋白的表達與模型組相比顯著減少(P＜0.01)，見表3。

表3 大鼠腎組織中CTGF蛋白的表達Tab 3 Expression level of CTGF protein in renal tissues of rats

3 討論

腺嘌呤致慢性腎衰竭大鼠模型在腎病的研究中應(yīng)用廣泛。腺嘌呤經(jīng)消化道吸收入血后，在肝臟內(nèi)代謝形成極難溶于水的2，8-二羥基腺嘌呤，在腎內(nèi)大量沉積形成結(jié)晶，阻塞、壓迫腎小管，引起腎小管上皮損傷，晚期出現(xiàn)腎小管間質(zhì)纖維化，造成腎功能損害，這種慢性腎衰竭模型與人類慢性腎衰竭所表現(xiàn)出來的代謝紊亂十分接近［3］。因此，本文應(yīng)用這種模型來研究海昆腎喜對慢性腎病的作用及其機制。

結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)是一種新近發(fā)現(xiàn)的致纖維化因子，是轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)的下游因子［4］。TGF-β是腎臟疾病中公認(rèn)的引起腎小球硬化和小管間質(zhì)纖維化的關(guān)鍵因子，但是由于TGF-β生物學(xué)功能比較復(fù)雜，單純抑制其生物活性可能引起許多難以預(yù)計的不良反應(yīng)［5］。研究表明，在組織纖維化過程中，TGF-β負面效應(yīng)主要由 CTGF途徑介導(dǎo)，而正面效應(yīng)則由非 CTGF途徑介導(dǎo)［6］。因此干預(yù) CTGF蛋白表達，既能保留TGF-β某些不依賴 CTGF的有益作用，又能消除其纖維增生作用，可能為腎纖維化的防治提供了一個新的、更安全的治療靶點，為慢性腎臟疾病的治療開辟新的道路。

海昆腎喜膠囊的主要成分是褐藻多糖硫酸酯，它是一種從海帶中提取的生物活性物質(zhì)，屬水溶性雜聚糖，其主要成分是L-巖藻糖-4-硫酸酯［7］，是一種高效吸附劑，可充分吸附大中小毒素物質(zhì)并將其直接排出體外，同時可以改善腎血流量，清除活性氧自由基而具有體內(nèi)抗氧化作用，降低血脂、降血糖以及免疫調(diào)節(jié)等多種作用［8］。既往實驗研究標(biāo)明海昆腎喜對于臨床慢性腎衰竭患者能夠降低 SCr、BUN，提高患者生活質(zhì)量，推遲開始透析時間，且無明顯毒副作用，患者耐受性好［9，10］。本實驗研究結(jié)果顯示，海昆腎喜可以明顯改善慢性腎衰竭模型大鼠攝食、精神狀態(tài)，增加尿量和體重減少等一般狀態(tài);可以明顯減少慢性腎衰竭模型大鼠尿蛋白的排泄、降低血肌酐和尿素氮，改善腎功能，明顯減輕腎臟的組織病理損害，從而起到對腎臟的保護作用，其可能的作用機理是通過下調(diào)CTGF蛋白的表達從而減輕腎纖維化的病程進展。

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