何子純 李升錦

(重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院呼吸科 重慶 400010)

結核分枝桿菌持留生存機制的研究進展

何子純 李升錦

(重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院呼吸科 重慶 400010)

全球約有1/3人口被結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)感染,但只有10%的感染者可發(fā)生結核病,而絕大多數(shù)是以潛伏感染形式存在。MTB的潛伏感染決定于MTB能在宿主體內以持留狀態(tài)存在的能力。處于持留狀態(tài)的MTB能抵抗巨噬細胞的吞噬殺滅作用,并能耐受通常對生長繁殖期的MTB具有殺滅作用的抗結核藥的殺滅作用[1]。因此,研究MTB進入代謝或休眠持留期和在持留狀態(tài)下存活的機制,進而尋找抑制其進入持留期和殺滅結核持留菌的方法,對于控制和根除結核病具有重要的臨床意義。

1 結核持留菌的研究背景

MTB是一種兼性細胞內寄生菌,并借胞內環(huán)境避免暴露于任何細胞外免疫系統(tǒng)。人們常以M TB在宿主體內以非增殖狀態(tài)存在從而造成延緩性病程和導致復發(fā)的潛伏形式稱為持留現(xiàn)象和持留性,引起這種現(xiàn)象的菌群稱為持留菌。結核持留菌的存在很早就得到體內外實驗的證實,20世紀 50年代McCune等[2]在 Cornell模型中用大劑量有毒株MTB感染小鼠,并讓疾病進展2周,再用抗結核藥物治療,后取小鼠的肺和脾臟培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)無MTB生長,停止治療間隔一段時間后MTB又會重新在這些組織出現(xiàn),因此McCune認為這些組織中可能存在休眠持留狀態(tài)的M TB[2]。1995年,de Wit等[3]用PCR法在一小鼠休眠結核病模型中證實,經異煙肼和利福平長期化療后培養(yǎng)無菌的組織內有MTBDNA的存在,化療停止后臟器培養(yǎng)可復陽。Wayne等[4]用逐漸降低培養(yǎng)液中氧濃度的方法將MTB誘導進入休眠持留狀態(tài),發(fā)現(xiàn)生長繁殖期MTB和休眠持留期MTB的異檸檬酸水解酶(isocitrate lyase,ICL)、觸酶以及超氧化物歧化酶等的濃度差異有統(tǒng)計學意義。然而目前仍不清楚是否細菌的發(fā)育狀態(tài)的改變使得他們不能被免疫系統(tǒng)識別,亦或是可能由于細菌表面模式的改變使其免疫原性改變而無法被免疫系統(tǒng)識別。隨著分子生物學研究的快速發(fā)展,對結核持留菌的認識也在不斷深入。

2 MTB持留生存機制

MTB持留生存機制是指MTB依靠自身和宿主的特性以及它們之間的相互作用在宿主體內長期存在的方式。該機制會導致結核菌潛伏感染、內燃復發(fā)、長期治療、結核菌耐藥性等一系列問題,因此深入研究MTB持留生存機制,查找MTB在宿主體內以非增殖狀態(tài)存在的本質原因,對于研制抗結核持留菌藥物有重要的支撐作用。

2.1 MTB代謝改變 M TB從生長繁殖期進入休眠持留期伴隨了某些酶、蛋白質等生物學特性的改變,以適應胞內低氧缺乏營養(yǎng)的環(huán)境。首先,MTB改變原有的有氧代謝途徑,轉向依靠乙醛酸循環(huán)支路獲取能量和碳源同時降低代謝率,維持其在胞內長期生存的需要。ICL是乙醛酸代謝途徑的一個關鍵酶,對M TB的持留性起著決定性的作用。McK-inney等[5]用敲除了icl基因的MTB感染小鼠的實驗證明,敲除株感染小鼠后很快被免疫系統(tǒng)清除,野生株菌負荷指數(shù)卻一直保持不變,顯示出持留性。其次,Cuuningham等[6]用轉換電子顯微鏡和SDSPAGE方法發(fā)現(xiàn)無氧條件下MTB細胞壁有增厚,且與16 kD的小熱休克蛋白高表達有關,M TB的細胞壁增厚有助于抵抗藥物進入細胞內,這也可能是藥物對MTB殺傷作用較弱的主要原因。細菌代謝表型的特異性是藥物篩選的重要性狀之一,深入了解控制代謝表達的基因,對尋找治療結核持留菌感染的藥物靶點有重要的指導作用。

2.2 影響吞噬溶酶體的形成 吞噬體與溶酶體融合形成吞噬溶酶體,是巨噬細胞抗原提呈和清除入侵病原微生物的重要途徑。最近研究報道[7-8]吞噬體的成熟是一個內質體與膜蛋白循環(huán)過程,M TB吞噬體卻可以特異地清除某些重要膜蛋白,使吞噬體不能有效成熟而不能與溶酶體融合。酸性微環(huán)境有利于溶酶體酶活性的發(fā)揮,但MTB不僅產生NH+4中和吞噬體的酸化,還能抑制質子-ATP酶降低吞噬體的酸化,并使含菌吞噬體與非溶酶體的內質體結合而阻礙吞噬溶酶體的形成[9]。Walburger等[10]還研究到敲除MTB的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶G(pknG)基因或利用特異性抑制劑阻斷激酶活性,可有效地促進巨噬細胞內含MTB的吞噬體與溶酶體發(fā)生融合,感染的MTB也很快被巨噬細胞殺滅。此外,有毒 MTB細胞壁含量最多的脂質物TDM(T rehalose 6,6-dimycolate)可通過減少吞噬體的酸化和阻礙吞噬溶酶體融合[11],吞噬溶酶體形成受阻,溶酶體中的酶就不能進入含菌吞噬體中作用,MTB就得以存活下來。

2.3 影響巨噬細胞信號傳導的活化 巨噬細胞受到刺激時能產生使其活化的信號,獲得殺菌活性。γ-干擾素(IFN-γ)是巨噬細胞活化的主要介質,MTB感染的巨噬細胞卻對IFN-γ刺激敏感性大大降低[12]。研究表明[13-14],MTB感染誘導巨噬細胞上調表達細胞因子信號傳導抑制因子(SCOS)和IL-6參與了這一過程。SCOS通過JAK/STAT信號傳導途徑抑制IFN-γ的功能,并抑制IFN-γ激活的下游基因表達;IL-6則通過某種不依賴信號傳導及轉錄活化因子l(STAT-1)的途徑抑制IFN-γ激活的下游基因表達,并降低未感染的巨噬細胞對IFN-γ刺激的敏感性。MTB的細胞壁大量表達一種含特殊多糖結構的糖基磷酯酰肌醇(GPI)-阿拉伯甘露糖(LAM),LAM能插入巨噬細胞細胞膜上富含GPI的區(qū)域。插入的LAM一方面可改變巨噬細胞的膜表面標記,抑制巨噬細胞向CD4+T細胞呈遞抗原的能力,降低CD4+T細胞分泌IFN-γ;另一方面可改變巨噬細胞膜上IFN-γ受體結構,使巨噬細胞對IFN-γ刺激的敏感性降低[15]。同時M TB細胞壁上的一種19X103脂蛋白能以Toll樣受體依賴的機制抑制IFN-γ誘導的下游基因表達,抑制巨噬細胞的活化[16]。

2.4 逃避ROI和RNI的殺傷作用 巨噬細胞活化后產生反應氧中間產物(ROI)和反應氮中間產物(RNI)消滅吞入的病原菌。研究發(fā)現(xiàn)不能產生ROI的D9變異型巨噬細胞與能正常產生ROI的未變異巨噬細胞對MTB殺傷活性表現(xiàn)一致。應用氧自由基清除劑(如超氧化物歧化酶、觸酶等)處理巨噬細胞,其殺結核菌能力也沒有明顯的變化,由此可知MTB對巨噬細胞產生的ROI有高度的耐受性。耐受機制可能是：MTB胞壁上的相關糖脂及菌體分泌的糖脂均有高效的氧自由基清除作用,可抑制巨噬細胞的呼吸爆發(fā)的殺傷;MTB產生的蛋白過氧化氫酶-過氧化物酶(KatG)具有錳離子依賴的過氧化物酶活性、細胞色素P450樣的加氧酶活性及過氧亞硝酸酶活性,在MTB抵抗ROI及RNI殺傷中起重要作用;MTB降低巨噬細胞的細胞色素C氧化酶的表達,抑制了呼吸爆發(fā),因為此酶是電子傳遞鏈終末環(huán)節(jié)的酶,從而逃避了殺傷[17]。

2.5 降低巨噬細胞的凋亡率 Balcewicz-Sablinska等分別用減毒株H37Ra和有毒株H37Rv感染巨噬細胞,并檢測2者誘導巨噬細胞凋亡的差異,發(fā)現(xiàn)前者明顯高于后者。進一步研究發(fā)現(xiàn)H37Rv感染組可溶性TNF-α受體-2(sTNFR-2)的水平明顯升高,且在H37Ra感染組培養(yǎng)液中外源加入sTNFR-2可使該組巨噬細胞的凋亡水平降至H37Rv感染組相一致的水平。因此可知MTB通過誘導sTNFR-2的表達上調來抑制巨噬細胞的凋亡作用[18]。同時H37Rv還能誘導巨噬細胞凋亡抑制因子Mcl-l的表達上調,和/或降低了巨噬細胞表面Fas的表達水平,減少巨噬細胞的凋亡[19-20]。另外,M TB胞壁的LAM也可通過 cAMP抑制劑等抑制細胞發(fā)生凋亡[21]。巨噬細胞凋亡率的下降保存了持留菌賴以生存的環(huán)境,是MTB持留生存過程中的重要步驟。將提高巨噬細胞的凋亡率作為殺滅持留菌的一個治療靶標具有一定的研究意義。

2.6 MTB持留的基因控制機制研究 MTB基因者組全序列的闡明及分子生物學技術的發(fā)展為闡明MTB持留現(xiàn)象的分子機制提供了有效的手段,研究發(fā)現(xiàn)MTB進入巨噬細胞后存在特殊的基因表達以適應胞內環(huán)境。至今主要有sigF,Msr,PcaA,PE家族等基因的研究。近期還發(fā)現(xiàn) relA基因可調控細菌的緩慢生長,誘導MTB進入休眠持留狀態(tài),Dahl等[22]用實驗作了進一步證明,并了解到relA基因主要調節(jié)了另2個與持留相關的hspX基因和eis基因的表達。hspX基因是能夠調節(jié)MTB進入休眠持留狀態(tài)的DosR蛋白的一個調節(jié)因子[23]。eis基因由于具有提高MTB在巨噬細胞中生存能力的作用而且特異性表達于致病的MTB復合群引起了人們特別關注[24]。當外周血淋巴細胞受到Eis抗原的刺激時,以Th2型細胞分泌IL-10的細胞免疫為主,活動性肺結核患者對Eis抗原的細胞免疫水平低下,經抗結核治療康復后細胞免疫維持在較高水平[25],而Th2型免疫反應則與感染的進展、持續(xù)和慢性化有關[26]?；蛐酒夹g為研究生長繁殖期和靜止持留階段MTB的基因表達差異提供了方便,但是確定哪些或者哪一個特定基因從本質上調控了MTB持留性,有待進一步的實驗證實。

3 針對結核持留菌的治療現(xiàn)況

現(xiàn)有的抗結核藥物對持留性MTB的殺傷作用非常弱,這也是抗結核化療時間較長的主要原因,過長的療程也極易導致耐藥菌的產生。研發(fā)抗結核持留菌藥物能明顯縮短治療周期,防止結核病內燃復發(fā),降低耐藥菌產生機率,具有重要的臨床意義。針對抗結核持留菌藥物研究大致可從3方面入手：(1)消滅MTB在藥物敏感的增值狀態(tài)阻止其進入持留進程;(2)將MTB持留菌殺死在持留狀態(tài);(3)使其復活進入藥物敏感狀態(tài)然后消滅它。

甲硝唑是研究較早的1個抗結核持留菌的藥物,Wayne等[27]利用逐漸降低培養(yǎng)環(huán)境中氧濃度的方法誘導的結核持留菌模型來檢測一定劑量的異煙肼、利福平、甲硝唑的抗結核效應,發(fā)現(xiàn)甲硝唑降低集落刺激單位(CFU)作用最明顯。但是甲硝唑對MTB的殺滅作用有一定的限制,故在臨床上應用較少[28]。另一藥物硝基咪唑并吡喃類(NAPs)化合物PA-824對低氧環(huán)境下培養(yǎng)的非復制期結核分枝桿菌模型有長期的殺菌作用,其活性類似于甲硝唑[29],現(xiàn)已進入臨床試驗階段。

異檸檬酸裂合酶(ICL)是MTB胞內厭氧代謝的關鍵酶,將ICL作為抗結核持留感染的藥物作用靶點,達到消滅宿主體內結核持留菌的目的,是最近國內外研究的一個熱點。體外具有活性的ICL抑制劑溴3-丙酮酸和3-硝基丙酸鹽正在篩選試驗研究中[30],針對該靶點的新的藥物也在積極的研發(fā)。同時國內學者還深入開展中藥的抗結核研究,詹莉等[31]報道了中藥貓爪草(小毛莨內酯)可能通過促進宿主細胞顆粒裂肽mRNA的表達,增強機體CTL殺菌能力,達到抗結核持留菌的作用。盡管中藥成分多,作用機制復雜,但隨著現(xiàn)代技術的發(fā)展,研發(fā)抗結核持留性的中藥復方制劑將有一定的前景。

4 結語

通過上面的闡述我們可以看出,目前雖然關于結核持留方面的研究很多,而這些研究結果也確實顯示與MTB持留生存相關,但是至今我們還沒有得到最清晰的MTB持留生存的機制,這也是為什么現(xiàn)在還未找到治療結核菌持留感染的方法的關鍵所在。MTB能夠在宿主體內持留生存或許是由多方面的因素決定的,但是也有可能存在某一關鍵因素,找到這一關鍵因素對控制和根除結核病將是一個重大的突破,隨著分子生物學技術的發(fā)展,基因水平的研究將是解決這一難題的一個重要突破口。

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重慶醫(yī)科大學科技創(chuàng)新基金資助項目(XB200512)

李升錦(lsj1025@163.com)

2009-03-30)

(本文編輯：張曉進)