王海兵 綜述 陳曉峰 審校

目前，肺癌仍為人類因癌癥死亡的主要原因[1]，全世界每年有150萬人死于肺癌。臨床上肺癌患者就診時(shí)大多已屬中晚期，錯(cuò)失手術(shù)機(jī)會(huì)，5年生存率不足15%[2]，肺癌如此高的死亡率與缺乏早期檢測(cè)手段及欠佳的治療措施有關(guān)，要想提高生存率，只有通過早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期手術(shù)治療等來實(shí)現(xiàn)。目前雖然對(duì)肺癌形成及發(fā)生發(fā)展機(jī)制已進(jìn)行了大量研究與探索，但其確切機(jī)制尚未明確。許多研究[3-5]表明，DNA甲基化與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一。在肺癌發(fā)生發(fā)展過程中，DNA甲基化修飾異常也扮演著重要角色。了解DNA甲基化修飾異常在肺癌發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制，將有助于肺癌患者的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療并改善預(yù)后。本文就DNA甲基化修飾異常在肺癌中的研究進(jìn)展綜述如下。

1 DNA甲基化

DNA甲基化是基因表觀遺傳學(xué)修飾方式之一，可能存在所有高等生物中。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，DNA甲基化是指生物體在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase,DNMTs）的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體將胞嘧啶核苷酸（C）第5位碳原子甲基化變?yōu)?’-甲基胞嘧啶（5’-mC）的一種反應(yīng)。而甲基胞嘧啶可以脫氨基轉(zhuǎn)化成胸腺嘧啶（T），造成C-T突變進(jìn)而導(dǎo)致某些基因突變而失活，這個(gè)過程調(diào)控了基因的表達(dá)。DNA甲基化常發(fā)生于CG二核苷酸密集區(qū)，這些區(qū)域被稱為CpG島，健康人基因組中，CpG島中的CpG位點(diǎn)通常是處于非甲基化狀態(tài)，而CpG島外的CpG位點(diǎn)則通常是甲基化的，這種甲基化的存在形式在細(xì)胞分裂過程中能夠穩(wěn)定保留[6]，并可以遺傳，是維持高度有序的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的重要因素。當(dāng)一些抑癌基因CpG島中的CpG序列呈高甲基化狀態(tài)時(shí)，其可致染色體螺旋程度增加及抑癌基因沉默和表達(dá)缺失[7]，引發(fā)腫瘤生長(zhǎng)。DNMTs在整個(gè)初始甲基化及甲基化的維持中發(fā)揮著重要作用，目前認(rèn)為DNMTs主要包括DNMTl、DNMT2、DNMT3a和DNMT3b共4個(gè)成員，其中DNMT1負(fù)責(zé)準(zhǔn)確復(fù)制DNA甲基化形式，起著維持甲基化的作用，DNMT2最初被認(rèn)為是一種DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶[8]，但是最近研究[9]發(fā)現(xiàn)其可以調(diào)節(jié)tRNA的甲基化，DNMT3a和DNMT3b被認(rèn)為是從頭甲基化轉(zhuǎn)移酶，主要負(fù)責(zé)非甲基化CpG位點(diǎn)的甲基化。DNA甲基化對(duì)基因表達(dá)的影響需要一些甲基化的CG序列結(jié)合蛋白（methyl-CpG-binding domain protein, MBDs）共同參與[10]，這些活性蛋白通過恢復(fù)組蛋白修飾和染色質(zhì)重構(gòu)酶作用促使染色質(zhì)纖維由10 nm的疏松結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)橐粋€(gè)濃聚的30 nm的螺旋結(jié)構(gòu)而發(fā)揮作用。DNA甲基化狀態(tài)可受感染、環(huán)境以及營(yíng)養(yǎng)因素的影響，但其機(jī)制還不清楚，可能是這些因素能影響DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的合成、活性和作用靶點(diǎn)，或者影響MBDs和脫甲基酶。

2 DNA甲基化與肺癌

到目前為止，在肺癌患者中已檢測(cè)出大量基因發(fā)生甲基化，大部分研究是基于外科手術(shù)獲得的非小細(xì)胞肺癌樣本。目前非小細(xì)胞肺癌樣本中集中研究的基因包括p16、RASSF1A、CDH1、CDH13、APC、RARβ、DAPK和MGMT[11]。其中p16基因位于人第9條染色體p21區(qū)，參與細(xì)胞周期蛋白調(diào)控，通過與細(xì)胞周期蛋白依賴激酶CDK4及CDK6結(jié)合而抑制后者活性，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖，是一種重要的抑癌基因，其失活與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，p16啟動(dòng)子區(qū)5’-CpG島甲基化是其失活的重要原因，在肺癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用。肺癌中p16基因甲基化頻率各學(xué)者報(bào)道不同，在肺癌組織中甲基化發(fā)生率大多在17%-80%，在肺癌患者血液中其發(fā)生率大多在13%-77.8%；Ras相關(guān)區(qū)域家族1A（RASSF1A）是人類腫瘤中甲基化頻率最高的一個(gè)抑癌基因，RASSF1A主要參與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)，該基因甲基化與肺癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后關(guān)系密切。綜合近幾年報(bào)道，RASSF1A在原發(fā)非小細(xì)胞肺癌中甲基化率在30%-40%，在小細(xì)胞肺癌中甲基化率幾乎可以達(dá)到80%[12]。Tomizawa等[13]報(bào)道110例I期肺腺癌患者RASSF1A甲基化率為35%，且分化差的腫瘤比高分化和中分化的腫瘤甲基化頻率高。最近張卉等[14]報(bào)道，非小細(xì)胞肺癌組織中RASSF1A啟動(dòng)子甲基化率為38.7%，20例肺良性病變中無一例發(fā)現(xiàn)RASSF1A啟動(dòng)子甲基化。Wang[15]研究發(fā)現(xiàn)deltaDNMT3B4的表達(dá)與RASSF1A啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)密切相關(guān)，他們通過RNA干擾技術(shù)敲除非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中的deltaDNMT3B4而導(dǎo)致RASSF1A啟動(dòng)子去甲基化而復(fù)活；CDH1、CDH13基因均屬于鈣粘蛋白家族，CDH1編碼的蛋白E-cadherin是一跨膜糖蛋白，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移方面起重要作用，是公認(rèn)的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移抑制基因。該基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化是E-cadherin失活的重要機(jī)制，目前報(bào)道的非小細(xì)胞肺癌中CDH1基因啟動(dòng)子CpG島甲基化率在15%-46%。王紅兵等[16]最近報(bào)道在肺癌組織中CDH1基因甲基化率為40.9%，明顯高于癌旁組織和正常組織，提示CDH1啟動(dòng)子CpG島甲基化可能參與肺癌的發(fā)生發(fā)展。CDH13基因是鈣粘家族的又一成員，編碼蛋白H-cadherin，起著抑癌基因作用，啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化是H-cadherin失活的重要機(jī)制；APC可抑制β-catenin，是家族性或散發(fā)性結(jié)腸癌相關(guān)抑癌基因，其啟動(dòng)子因甲基化而失活在肺癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用也被證實(shí)。Brabender[17]報(bào)道在非小細(xì)胞肺癌組織中APC甲基化率高達(dá)94%，而正常對(duì)照組僅20%發(fā)生甲基化。RAR-β主要調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)過程。Virmani等[18]報(bào)道RAR-β基因甲基化率為28%，且與腫瘤細(xì)胞分化程度密切相關(guān)，在非小細(xì)胞肺癌患者的預(yù)后方面具有臨床參考價(jià)值；死亡相關(guān)蛋白激酶DAPK基因作為抑癌基因具有調(diào)節(jié)凋亡的功能，與肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其因啟動(dòng)子甲基化而表達(dá)缺失可導(dǎo)致多種腫瘤發(fā)生。O6-甲基鳥嘌呤-DNA-甲基轉(zhuǎn)移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferase,MGMT）是一種高效修復(fù)酶，能修復(fù)DNA序列中6-氧-甲基鳥嘌呤損傷，對(duì)維持基因組的穩(wěn)定性有重要意義，該基因的表達(dá)缺失可以導(dǎo)致肺癌的發(fā)生發(fā)展，其啟動(dòng)子區(qū)甲基化是MGMT去表達(dá)的重要機(jī)制。Esteller等[19]報(bào)道非小細(xì)胞肺癌組織標(biāo)本中MGMT甲基化發(fā)生率為29%?？自泼鞯萚20]報(bào)道肺癌患者血漿標(biāo)本中MGMT甲基化率為24.62%。研究[21]發(fā)現(xiàn)MGMT啟動(dòng)子甲基化可能與p53突變相關(guān)。另外，與非小細(xì)胞肺癌相關(guān)的甲基化基因還有：FHIT、HIC-1、AKAPl2、ESRl、CYGB、OPCML、ADAMTSl、TGFBI、RUNX3、UMDl、hSRBC、CADM1、p14ARF、p16INK4a、DAPK、GSTP1、MGMT、MLH1、FBN2、DAL-1、ASC等[22-28]。

最新發(fā)現(xiàn)的幾個(gè)肺癌相關(guān)基因甲基化如下：Zhang等[29]研究了78對(duì)非小細(xì)胞肺癌組織、癌旁組織及25個(gè)良性病變組織發(fā)現(xiàn)DLEC1基因甲基化率分別為41%、3.8%和0，DLEC1甲基化程度與肺癌分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)。他們還檢測(cè)了肺癌患者血漿樣本中DLEC1甲基化率為35.9%，而非癌患者血漿中該基因甲基化率僅為2%，DLEC1在血漿中甲基化狀態(tài)和組織中一致性較好。DLEC1基因啟動(dòng)子甲基化在肺癌組織中表達(dá)沉默，而在癌旁和良性病變組織中則廣泛表達(dá)。Nagji等[30]研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌轉(zhuǎn)移抑制基因1（breast cancer metastasis suppressor 1, BRMS1）的mRNA和蛋白表達(dá)在非小細(xì)胞肺癌中明顯降低，他們發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌樣本BRMS1啟動(dòng)子甲基化率明顯高于癌旁組織，在鱗癌中該差別更明顯。BRMS1啟動(dòng)子甲基化與臨床病例特征聯(lián)系分析得知在鱗癌中BRMS1甲基化與病理分期相關(guān)。Suzuki等[31]檢測(cè)了17個(gè)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株和236個(gè)非小細(xì)胞肺癌組織標(biāo)本中CXCL12的mRNA和甲基化狀況發(fā)現(xiàn)，CXCL12在236個(gè)肺癌組織中甲基化率為36%，CXCL12甲基化狀態(tài)和其表達(dá)顯著相關(guān)。他們認(rèn)為CXCL12沉默在非小細(xì)胞肺癌中是個(gè)頻繁的事件。Chang等[32]研究發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌中RECK啟動(dòng)子甲基化率為63.6%，其表達(dá)下調(diào)與該基因啟動(dòng)子甲基化密切相關(guān)，K-ras基因的密碼子12在肺癌組織中突變率為25.5%，統(tǒng)計(jì)分析顯示K-ras突變與RECK啟動(dòng)子甲基化密切相關(guān)，他們認(rèn)為在非小細(xì)胞肺癌中RECK下調(diào)是由于啟動(dòng)子甲基化引起的，且與K-ras突變和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。Yu等[33]報(bào)道，EPHB6啟動(dòng)子甲基化引起基因表達(dá)下調(diào)，在非小細(xì)胞肺癌侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，其高甲基化狀態(tài)可增加非小細(xì)胞肺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。Rui等[34]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BLN-3基因在非小細(xì)胞肺癌組織中甲基化率為43.1%，比相應(yīng)正常組織甲基化率（9.2%）明顯增高，且FBLN-3高甲基化與其mRNA和蛋白水平表達(dá)下調(diào)相關(guān)，研究還表明FBLN-3甲基化狀態(tài)與肺癌分化程度、分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。

目前大多數(shù)甲基化研究大多集中在非小細(xì)胞肺癌中，而對(duì)小細(xì)胞肺癌的研究較少。Kreisler等[35]研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元抑制沉默因子/RE1沉默轉(zhuǎn)錄因子（neuron restrictive silencer factor or RE1-silencing transcription factor,NRSF/REST）是小細(xì)胞肺癌進(jìn)展的一個(gè)重要調(diào)節(jié)劑，在小細(xì)胞肺癌中NRSF/REST本身起腫瘤抑制因子作用，NRSF/REST因自身甲基化和CREB調(diào)節(jié)而失活，NRSF/REST的丟失導(dǎo)致表皮生長(zhǎng)因子介導(dǎo)的AKT磷酸化，對(duì)細(xì)胞增生和生存有重要意義。Wang等[36]用Illumina Beadchip assay檢測(cè)了44對(duì)小細(xì)胞肺癌和對(duì)照組外周血白細(xì)胞DNA的52個(gè)基因的62個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化表達(dá)差異，并用pyrosequencing技術(shù)驗(yàn)證了9個(gè)CpG位點(diǎn)，統(tǒng)計(jì)分析甲基化差異發(fā)現(xiàn)這9個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化預(yù)示一個(gè)較高的小細(xì)胞肺癌危險(xiǎn)度，可能有助于小細(xì)胞肺癌的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)和診斷。他們發(fā)現(xiàn)CSF3R和ERCC1甲基化聯(lián)合檢查對(duì)區(qū)別小細(xì)胞肺癌和對(duì)照組意義較大。

3 DNA甲基化在肺癌中的應(yīng)用

3.1 DNA甲基化在肺癌早期診斷中的應(yīng)用 目前肺癌相關(guān)基因甲基化異常不僅在肺癌組織中被檢測(cè)[29-31]，在肺癌患者的血清或血漿[37,38]、痰[39,40]、支氣管刷檢和活檢標(biāo)本[41,42]中也能夠檢測(cè)到，最近Han等[43]認(rèn)為DNA甲基化能夠在呼出氣的冷凝液中檢測(cè)到。這些樣本的最大好處是較易獲得，在這些樣本中檢測(cè)DNA甲基化對(duì)肺癌早期檢測(cè)及診斷具有潛在的用途。Licchesi等[44]對(duì)癌旁正常組織、肺腺瘤型增生過長(zhǎng)組織（癌前病變）及相應(yīng)的肺腺癌組織中7個(gè)基因甲基化進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)甲基化的頻率從正常組織到肺腺瘤型增生過長(zhǎng)組織（癌前病變）再到腺癌是明顯增加的。這證明某些基因的甲基化可能是肺癌發(fā)展中的一個(gè)早期標(biāo)志，且甲基化程度隨惡性演變而增加。同時(shí)對(duì)幾個(gè)基因的甲基化檢測(cè)可能成為肺癌早期檢測(cè)和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的一個(gè)生物指標(biāo)。

3.2 DNA甲基化在預(yù)測(cè)肺癌復(fù)發(fā)及預(yù)后中的應(yīng)用 有研究發(fā)現(xiàn)DNA甲基化與肺癌的復(fù)發(fā)情況相關(guān)，Brock等[45]研究了I期非小細(xì)胞肺癌術(shù)后血中DNA甲基化與肺癌復(fù)發(fā)情況的關(guān)系發(fā)現(xiàn)在肺癌組織和非轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)中p16、CDH13、RASSF1A和APC的甲基化狀態(tài)與肺癌的復(fù)發(fā)情況相關(guān)，如果p16和CDH13在腫瘤組織和縱隔淋巴結(jié)中被檢測(cè)是高甲基化狀態(tài)，則其復(fù)發(fā)的優(yōu)勢(shì)比為15.5，作者認(rèn)為這些基因在正常淋巴結(jié)中高甲基化提示可能存在顯微鏡無法檢測(cè)到的微轉(zhuǎn)移灶，某些基因的高甲基化可能使細(xì)胞具有轉(zhuǎn)移擴(kuò)步的潛性，對(duì)預(yù)測(cè)疾病的復(fù)發(fā)情況可能有意義。原發(fā)性非小細(xì)胞肺癌中某些基因的甲基化可作為其預(yù)后不良的一個(gè)指標(biāo)。Tang等[46]報(bào)道DAPK甲基化狀態(tài)與I期非小細(xì)胞肺癌患者的生存密切相關(guān)，這些發(fā)現(xiàn)在后來也被Lu等[47]研究證實(shí)。Burbee[48]和張卉[14]報(bào)道RASSF1A基因甲基化可作為非小細(xì)胞肺癌預(yù)后不良的一個(gè)指標(biāo)。Kim[49]以及Tomizawa[13]也報(bào)道RASSF1A甲基化可作為I期肺腺癌預(yù)后不良的一個(gè)指標(biāo)。Toyooka等[50]報(bào)道p16的甲基化狀態(tài)與肺腺癌的預(yù)后不良顯著相關(guān)。在I期非小細(xì)胞肺癌中，Yanagawa[51]發(fā)現(xiàn)RASSF1A和RUNX3甲基化與預(yù)后不良有關(guān)。Brabender[17]報(bào)道APC基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化與患者低生存率相關(guān)。Seng等[52]研究也發(fā)現(xiàn)DLEC1甲基化在原發(fā)性非小細(xì)胞肺癌中（包括鱗癌）是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)，hMLH1甲基化是影響大細(xì)胞肺癌預(yù)后的一個(gè)指標(biāo)。Nagji等[30]認(rèn)為BRMS1是非小細(xì)胞肺癌一個(gè)預(yù)后不良的指標(biāo)。 Suzuki等[31]分析顯示CXCL12甲基化與非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后密切相關(guān)，對(duì)CXCL12的甲基化分析可能成為非小細(xì)胞肺癌患者術(shù)后預(yù)后指標(biāo)。

3.3 DNA甲基化的逆轉(zhuǎn)在肺癌治療中的應(yīng)用 基于DNA甲基化導(dǎo)致抑癌基因沉默促使腫瘤發(fā)生的機(jī)理，用能夠逆轉(zhuǎn)甲基化的藥物改變沉默基因的甲基化狀態(tài)是目前一直在研究的用來治療肺癌的一種手段。過去幾年里，逆轉(zhuǎn)基因甲基化改變的方法或藥物已有報(bào)道，主要包括腺苷類DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑和非腺苷類DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑。5-氮雜胞苷和5-氮-2'-脫氧胞苷作為腺苷類DNMT抑制劑通過共價(jià)鍵與DNMT形成穩(wěn)定的中間體而使DNMT失活，導(dǎo)致DNA去甲基化和沉默基因重新表達(dá)。目前該類藥物主要用于血液系統(tǒng)腫瘤的治療。非腺苷類DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑主要是抑制DNMT活性，其主要包括EGCG（一種多酚化合物）、MG98（一種反義寡核苷酸）、普魯卡因、普魯卡因胺和肼屈嗪等。此外，還有些去甲基化的研究如：小分子干擾RNA（small interfering RNAs, siRNA）通過與DNMT mRNA結(jié)合導(dǎo)致其降解和基因沉默，從而使DNA發(fā)生去甲基化[53]。這些研究有望為肺癌治療提供一種新方法。

4 結(jié)語(yǔ)

DNA異常甲基化與肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，肺癌在其發(fā)生與發(fā)展過程中存在一系列基因異常甲基化。通過檢測(cè)多個(gè)基因甲基化情況可對(duì)肺癌進(jìn)行早期檢測(cè)、診斷和判斷復(fù)發(fā)及預(yù)后情況，同時(shí)了解DNA甲基化修飾異常在肺癌發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制，可以用去甲基化藥物使甲基化沉默基因重新表達(dá)，有望為肺癌的臨床治療提供新方法。然而其在肺癌診斷及治療中的應(yīng)用還存在一些問題，如目前甲基化研究多基于腫瘤組織，雖在血漿、痰和其它樣本中也可檢測(cè)到，但其靈敏性和特異性不如腫瘤組織，且在血液中不一定有足夠能檢測(cè)到的腫瘤DNA，特別在腫瘤的早期階段，還有血液中的腫瘤標(biāo)記物沒有器官特異性，不能判斷一定是肺癌；痰標(biāo)本在吸煙人群較易獲得，但在不吸煙人群不易獲得[11]，且來自肺中央的痰標(biāo)本不一定能夠檢測(cè)出周圍型肺癌。另外，雖同時(shí)對(duì)多個(gè)基因甲基化檢測(cè)比檢測(cè)一個(gè)基因?qū)Ψ伟┰\斷的敏感性和特異性高，但是哪一組基因甲基化有較高靈敏度和特異性，這些都是肺癌診斷中存在的問題?；蛉ゼ谆委熌[瘤也存在一些問題，如去甲基化藥物雖可以改變DNA甲基化模式，但由于其可逆性的特征，同樣有可能恢復(fù)到原始的甲基化狀態(tài)，且長(zhǎng)時(shí)間大劑量給予甲基化抑制劑可能產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用，如惡心、嘔吐、骨髓抑制、甚至基因突變導(dǎo)致其它腫瘤發(fā)生等。因此對(duì)于晚期肺癌患者，是否將去甲基化藥物用于腫瘤治療還有待進(jìn)一步研究。