邱龍華 馮曉源

血管生成(angiogenesis)在各種正常和病理組織生長(zhǎng)過程中具有關(guān)鍵的調(diào)制作用,而對(duì)于實(shí)體腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為尤為重要。因此,近來抗血管生成治療也成為腫瘤治療的一種新興、有效的手段和方法。鑒于此,對(duì)于新生血管生成過程進(jìn)行影像學(xué)評(píng)價(jià)便具有非常重要的臨床意義和應(yīng)用價(jià)值[1-3]。

目前,腫瘤血管成像可分為間接成像和直接成像兩類[3]。間接成像技術(shù)(如CT灌注、MRI灌注、微球造影彩色Dopp ler超聲、PET腦血流灌注成像等)主要通過提供組織血流量、血容量和血管通透性等信息,反映血管的組織和功能特征,并已較多應(yīng)用于臨床診斷和研究中[3-7]。但是,間接成像技術(shù)不能真實(shí)反映血管、尤其是腫瘤血管生成的實(shí)際情況,所提供的主要是血管的某些功能性特征,缺乏量化指標(biāo),不能早期診斷腫瘤,因此具有一定的局限性。

直接成像通過將某些靶向造影劑血管內(nèi)注射,使之與血管內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)特異性結(jié)合,達(dá)到血管顯影的作用[3]。目前,直接成像主要?dú)w于分子影像學(xué)的范疇。腫瘤血管生成過程中,某些蛋白質(zhì)分子表達(dá)上調(diào),利用相應(yīng)的配體(如肽類、蛋白質(zhì)和抗體等),以影像標(biāo)記物質(zhì)(如放射性核素、超聲微球、熒光染料、順磁性顆粒等)標(biāo)記后作為示蹤劑(tracer),與這些特定的靶向分子結(jié)合,就可以進(jìn)行PET、超聲、光學(xué)及MRI血管成像[8]。本文主要對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子/受體(vascular endothelial grow th factor/VEGF receptors,VEGF/VEGFRs)在分子成像中的應(yīng)用及進(jìn)展進(jìn)行綜述。

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子/受體(VEGF/VEGFRs)

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子/受體(VEGF/VEGFRs)信號(hào)通路在正常血管形成和某些病變(如腫瘤)血管生成過程中具有重要作用[8-11]。VEGF家族包括多種同源蛋白:VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F和胎盤生長(zhǎng)因子,各種VEGF蛋白具有相似的生物學(xué)作用,其中VEGF-A在血管生成過程中最為重要。VEGF-A包括VEGF 121、VEGF 165和VEGF189等五種亞型,不同亞型間生物學(xué)性質(zhì)各有不同。VEGFs可以與三種特異性的受體(VEGFRs)結(jié)合:VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3,前兩者主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞和造血細(xì)胞表面表達(dá),后者表達(dá)于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞。VEGFR與相應(yīng)VEGF結(jié)合后均可表現(xiàn)為酪氨酸蛋白激酶活性,介導(dǎo)信號(hào)的傳導(dǎo)過程[9]。

多項(xiàng)臨床研究顯示,腫瘤預(yù)后與VEGF表達(dá)呈相關(guān)性,高表達(dá)腫瘤往往預(yù)后更差。目前,臨床已應(yīng)用抗VEGF-A的單克隆抗體藥物(Bevacizum ab,貝伐單抗)進(jìn)行腫瘤的抗血管治療,其機(jī)制是阻斷VEGF在腫瘤血管生成過程中的調(diào)節(jié)作用。因此對(duì)VEGF/VEGFR進(jìn)行靶向分子顯像,能對(duì)抗腫瘤血管生成治療療效進(jìn)行評(píng)價(jià),提高腫瘤治療的合理性和針對(duì)性。

SPECT和PET顯像

SPECT較PET更早應(yīng)用于VEGF/VEGFRs分子成像。但是與SPECT相比,PET成像具有更高的敏感性,PET/CT使得圖像分辨率得到提高,臨床應(yīng)用更為直接、便利和廣泛。常用的放射性核素有123I,111In,99mTc和64Cu等。

對(duì)于循環(huán)或腫瘤VEGF分子表達(dá)水平的測(cè)定分級(jí),有助于描述腫瘤血管生成的生物學(xué)屬性,判斷腫瘤的侵襲性和預(yù)后[12,13],指導(dǎo)抗血管藥物治療策略的制定。Stollm an等[14]及 Nagengast等[15]研究利用核素標(biāo)記VEGF單克隆抗體Bevacizumab制備相應(yīng)探針,進(jìn)行腫瘤SPECT或PET成像。注射探針后一天之內(nèi),探針主要存在于血流灌注大的器官及血漿中,之后逐漸清除,3天時(shí)腫瘤攝取明顯增高,腫瘤/非腫瘤攝取比增高,7天時(shí)相對(duì)攝取比達(dá)到峰值。競(jìng)爭(zhēng)性拮抗實(shí)驗(yàn)或核素標(biāo)記非特異性抗體成像均提示:腫瘤對(duì)于Bevacizumab抗體探針的攝取是VEGF-A特異性介導(dǎo)的,而非血管灌注或被動(dòng)彌散等因素引起。目前對(duì)于VEGF的核素成像主要集中于對(duì)VEGF抗體探針體內(nèi)分布及清除進(jìn)行研究[14-16],而VEGF表達(dá)在抗腫瘤治療前后的變化及其作用意義還未有相關(guān)研究報(bào)道。

由于VEGF與其受體間具有天然的、高親和、高特異的結(jié)合能力,因此目前研究均使用核素標(biāo)記的各種VEGF亞型作為配體對(duì)VEGFRs進(jìn)行相應(yīng)的靶向成像。VEGF-A亞型VEGF121及VEGF 165的應(yīng)用最多。123I標(biāo)記的VEGF121和VEGF 165已應(yīng)用于人胃腸道、胰腺等多種腫瘤核素成像,并對(duì)探針體內(nèi)分布、腫瘤攝取率及清除等進(jìn)行分析[17,18]。

Yoshimoto等[19]研究顯示,123I-VEGF 121在人LS180結(jié)直腸腫瘤中的攝取高于123I-VEGF165,而清除速度明顯慢于后者。同時(shí),這兩種探針在同一或不同組織內(nèi)的分布、攝取均有較大差別,其可能機(jī)制在于:VEGF121、VEGF165對(duì)于VEGFR-1(flt-1)及VEGFR-2(KDR)的親和性不同,而不同組織血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)VEGFR-1和VEGFR-2又具有差異性。該研究還顯示,腫瘤內(nèi)的123I-VEGF121攝取率隨腫瘤增大而減低,提示VEGFR的表達(dá)可能與腫瘤大小具有一定相關(guān)性,較小的腫瘤表達(dá)高于較大的腫瘤。Cai等[20]的研究也有類似結(jié)果。利用64Cu標(biāo)記的VEGF121對(duì)人 U87MG膠質(zhì)瘤VEGFR表達(dá)進(jìn)行PET成像,64Cu-DOTA-VEGF121能快速、特異性和顯著的被體積較小的U87MG腫瘤攝取,注射23h內(nèi),腫瘤攝取率大于14.9%ID/g。而體積較大的U 87MG腫瘤攝取率明顯較低,僅腫瘤周邊散在攝取,攝取率低于3%～4%ID/g。腫瘤攝取率與大小間的關(guān)系通過免疫熒光技術(shù)獲得證實(shí),體積較小的腫瘤VEGFR-2的表達(dá)明顯高于較大體積腫瘤。利用非侵入性的影像學(xué)方法,研究不同類型、不同大小腫瘤VEGFR表達(dá)水平的差異性,有利于指導(dǎo)臨床決定是否、或者何時(shí)進(jìn)行抗血管治療,以提高腫瘤治療的有效性。

研究發(fā)現(xiàn),在腫瘤血管生成及腫瘤演進(jìn)過程中,VEGFR-2的作用較VEGFR-1更為重要。如前所述,目前大多數(shù)基于VEGF-A為配體的VEGFR分子探針均可同時(shí)與VEGFR-1和VEGFR-2結(jié)合。由于腎臟等器官中可表達(dá)高水平的VEGFR-1,腎臟對(duì)于這些探針?biāo)幬锏臄z取累積較高,這會(huì)導(dǎo)致腎臟藥物代謝負(fù)擔(dān)和腎毒性的增加[11,21]。因此近來有學(xué)者對(duì)VEGFR-2特異性的VEGFR顯像進(jìn)行研究[21]。研究人員通過DNA重組技術(shù)合成了VEGF 121的變異體VEGFDEE,與VEGF121相比,VEGFDEE與VEGFR-1親和性降低20倍,而與VEGFR-2的親和性無明顯減低。64Cu-DOTA-VEGFDEE腎臟攝取顯著低于64Cu-DOTA-VEGF121,從而降低了腎毒性,有利于藥物探針的臨床應(yīng)用。

超聲成像

對(duì)于VEGF/VEGFRs超聲成像的報(bào)道較少。最近的一項(xiàng)研究[22]應(yīng)用特異性鼠VEGFR-2單克隆抗體標(biāo)記的超聲微球,對(duì)鼠SVR血管肉瘤及C 6膠質(zhì)瘤模型進(jìn)行成像。注射探針微球后,兩種腫瘤的超聲信號(hào)均明顯增強(qiáng),競(jìng)爭(zhēng)性阻斷后(應(yīng)用過量VEGFR-2單克隆抗體拮抗),腫瘤信號(hào)明顯降低。用免疫球蛋白標(biāo)記的對(duì)照微球,僅由于較弱的非特異性結(jié)合引起腫瘤信號(hào)輕度增加。

Korpanty等[23]和Palmow ski等研究[24]對(duì)腫瘤治療前后VEGFR-2表達(dá)進(jìn)行超聲成像定量分析。荷人胰腺癌和鱗癌裸鼠化療前后,注射VEGFR-2抗體結(jié)合微球,超聲定量測(cè)定腫瘤內(nèi)微球濃度。結(jié)果均顯示,治療組腫瘤內(nèi)與VEGFR-2特異性結(jié)合的微球濃度明顯減低,超聲信號(hào)減低,尤其在腫瘤周邊部,超聲信號(hào)減低更為顯著,而對(duì)照組濃度顯著升高。免疫組化結(jié)果也證實(shí),治療組VEGFR-2染色陽性分?jǐn)?shù)及CD 31微血管密度等均顯著低于對(duì)照組。因此,對(duì)于VEGFR-2表達(dá)進(jìn)行測(cè)定,可以用于對(duì)治療療效進(jìn)行評(píng)價(jià)監(jiān)測(cè),指導(dǎo)臨床合理用藥。

以上的實(shí)驗(yàn)均表明,VEGFR-2單克隆抗體標(biāo)記的微球,能特異性的和腫瘤血管內(nèi)皮VEGFR-2結(jié)合,用于血管VEGFR-2表達(dá)的定量分析、監(jiān)測(cè)腫瘤血管治療療效。

光學(xué)成像

常用的光學(xué)成像技術(shù)有熒光成像和生物發(fā)光成像。光學(xué)成像具有多功能、高敏感性、成像過程相對(duì)簡(jiǎn)單等特點(diǎn),盡管受到空間分辨率和組織探測(cè)深度等限制,目前還是較多地應(yīng)用于小型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的全身成像研究中[25,26],而近紅外光學(xué)成像在荷腫瘤動(dòng)物光學(xué)成像中應(yīng)用較廣泛。

有研究[27]采用單鏈VEGF與花青染料Cy5.5結(jié)合制備光學(xué)顯像劑scVEGF/Cy,對(duì)鼠4T1和人MDA-MB-231乳腺腫瘤進(jìn)行近紅外成像。研究首先采用生物發(fā)光成像技術(shù) (BLI)確定腫瘤邊界,行scVEGF/Cy熒光成像后,可見BLI確定的腫瘤范圍內(nèi)選擇性的熒光探針攝取作用。而對(duì)VEGF/Cy進(jìn)行滅活或預(yù)先行scVEGF競(jìng)爭(zhēng)拮抗,則探針?biāo)幬锏臄z取明顯受抑制,成像信號(hào)減弱。以上結(jié)果也證實(shí)成像過程中VEGF受體結(jié)合的重要作用。

多項(xiàng)研究顯示,放療、化療或光敏感療法(PDT)等抗腫瘤治療會(huì)引起腫瘤VEGF表達(dá)上調(diào),導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移等侵襲性增高[28]。Chang等[29]利用抗VEGF抗體結(jié)合熒光染料制備相應(yīng)探針 (CAVEGF)進(jìn)行光學(xué)成像,與不同腫瘤血管VEGF特異性結(jié)合后測(cè)定熒光信號(hào),顯示了與體外定量ELISA結(jié)果間良好的相關(guān)性。行PDT治療后1h,各種腫瘤熒光信號(hào)即有明顯增高,24h后經(jīng)ELISA證實(shí),腫瘤VEGF濃度較治療前增加2倍以上。臨床上,針對(duì)放化療后VEGF表達(dá)上調(diào)的患者,增加抗血管治療,可以提高療效,降低復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的可能性。因此在治療中對(duì)VEGF表達(dá)水平進(jìn)行監(jiān)測(cè)就具有了重要的臨床應(yīng)用價(jià)值和意義。

MRI成像

目前,磁共振技術(shù)(MRI)對(duì)VEGF/VEGFRs進(jìn)行直接成像尚未有相關(guān)報(bào)道。一些研究利用動(dòng)態(tài)增強(qiáng)MRI(DCE-MRI)對(duì)腫瘤血管通透性等進(jìn)行分析,研究其與腫瘤VEGF表達(dá)的相關(guān)性[30],也有研究利用MRI解剖成像功能對(duì)其他分子影像技術(shù)相應(yīng)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證[31]。但MRI已用于對(duì)體內(nèi)其他蛋白(如整合素αvβ3)進(jìn)行分子成像[32,33],并顯示了較好的應(yīng)用價(jià)值。MRI與其他分子影像技術(shù)相比,具有更高的空間和時(shí)間分辨率,無放射性損傷等優(yōu)勢(shì)。但是MRI對(duì)體內(nèi)生物信號(hào)探測(cè)的敏感性卻較低,曾限制了該技術(shù)在分子影像中的應(yīng)用。然而隨著納米材料的不斷研發(fā)和應(yīng)用,這一限制被逐步突破。納米顆粒具有較大的表面積,可以攜帶大量的釓劑或UPIO顆粒,從而極大地提高了生物信號(hào),有利于MRI的探測(cè)[34]。相信基于MRI技術(shù)的VEGF/VEGFRs分子成像會(huì)較快應(yīng)用于基礎(chǔ)和臨床研究。

分子成像展望

由于各種分子成像技術(shù)均有一定的局限,單一應(yīng)用某種技術(shù)進(jìn)行成像往往不能獲得全面準(zhǔn)確的信息。近來,多模式的分子成像成為研究的重點(diǎn)。采用多模式進(jìn)行成像,通過引入單一探針造影劑,可以同時(shí)完成兩種或更多的成像過程,使得各種技術(shù)所得到的結(jié)果具有可比性、參照性,同時(shí)充分結(jié)合各種技術(shù)優(yōu)勢(shì),獲得更為滿意的成像效果,提高成像的準(zhǔn)確性[2,3,8,34]。

在多模式分子成像過程中,納米顆粒技術(shù)的應(yīng)用同樣至關(guān)重要[34]。納米顆?？梢酝瑫r(shí)結(jié)合多種分子,如靶向結(jié)合配體、影像標(biāo)記物或者治療性藥物等。目前,利用納米顆粒合成的多功能(如PET/光學(xué),PET/MRI,MRI/光學(xué)等)分子成像探針已經(jīng)應(yīng)用在某些實(shí)驗(yàn)研究中。如最近,有學(xué)者合成了基于鐵氧 (Iron oxide,IO)納米顆粒的PET/MRI雙功能探針[35]。該雙功能探針的制備是通過鐵氧納米顆粒包被聚合天冬氨酸(PASP)提供表面結(jié)合部位,并分別與RGD肽及DOPT-64Cu結(jié)合,制備成64Cu-DOPT-IO-RGD探針。利用該探針可以對(duì)腫瘤內(nèi)αvβ3同時(shí)或分別進(jìn)行成像,兩者結(jié)果具有較好的相關(guān)性?？梢韵胂?類似的探針同樣可以應(yīng)用于VEGF/VEGFRs的多模式分子成像中。

多模式的成像目前還處于研究初期,對(duì)于藥物探針在體內(nèi)代謝、分布、生物兼容性、毒性和靶向結(jié)合等生物學(xué)性質(zhì)還有待進(jìn)一步探索和研究。在不久的將來,非侵入性的多模式成像技術(shù)會(huì)普遍應(yīng)用于臨床研究中。

腫瘤血管生成成像的意義

腫瘤血管生成成像,尤其是分子成像的發(fā)展和臨床應(yīng)用,使得腫瘤的臨床前期診斷和治療成為可能。作為非侵入性的診斷方法,多種影像技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于基礎(chǔ)以及臨床研究中,提供了病變探測(cè)、藥物應(yīng)用篩選、治療有效性和監(jiān)測(cè)、疾病預(yù)后等多方面的大量重要信息。

VEGF/VEGFRs及其他相關(guān)的生物信號(hào)分子、蛋白質(zhì)(如αvβ3,Endoglin-CD105等)在腫瘤血管生成中具有重要的、乃至中樞核心的調(diào)節(jié)作用。對(duì)這些分子進(jìn)行成像,有助于更好地理解腫瘤血管生成在腫瘤發(fā)生發(fā)展、演進(jìn)、轉(zhuǎn)移等過程中的作用。研究顯示,腫瘤內(nèi)VEGF/VEGFRs表達(dá)與腫瘤的生物學(xué)性質(zhì)(如生長(zhǎng)速度、侵襲性及轉(zhuǎn)移等)相關(guān),應(yīng)用PET等成像技術(shù),檢測(cè)其表達(dá)水平,可以對(duì)腫瘤進(jìn)行分級(jí),判斷其惡性程度,并對(duì)預(yù)后進(jìn)行預(yù)測(cè)。

如前所述,腫瘤在其生長(zhǎng)及治療過程中,血管內(nèi)皮細(xì)胞表面VEGF/VEGFRs表達(dá)水平可發(fā)生變化,這就對(duì)腫瘤藥物、放射治療的實(shí)施提出了新的研究課題。腫瘤治療過程中,應(yīng)及時(shí)調(diào)整方案,多種治療方法同時(shí)或序貫進(jìn)行;腫瘤抗血管治療也不僅做到個(gè)體化,對(duì)同一個(gè)患者,也存在著治療時(shí)間窗。對(duì)VEGF/VEGFRs的表達(dá)變化進(jìn)行分析,可以指導(dǎo)治療措施的制定,避免不必要、無效的藥物治療導(dǎo)致的藥物毒性作用,提高抗血管藥物治療的針對(duì)性和時(shí)效性,增加放射治療的方向性。

對(duì)于腫瘤治療前后各種蛋白質(zhì)表達(dá)水平對(duì)比檢測(cè),還可用于進(jìn)行治療效果的評(píng)價(jià)。同時(shí),目前已有多項(xiàng)研究,在同一納米顆粒上結(jié)合靶向配體、影像標(biāo)記物和治療性藥物,制備成具有多功能的分子探針。在完成特異性分子結(jié)合成像的同時(shí),對(duì)腫瘤進(jìn)行靶向治療,增加了治療針對(duì)性,降低全身毒性作用,并通過腫瘤對(duì)探針?biāo)幬飻z取量的變化等,對(duì)療效進(jìn)行評(píng)價(jià)。