王洪躍，戴曉云

?

現(xiàn)代動物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器概述

王洪躍，戴曉云

430060 武漢生物制品研究所（王洪躍）；200122 上海，瑞士比歐公司（戴曉云）

動物細(xì)胞在很多方面是不同于原核細(xì)胞和真菌的，例如較低的生長率、較高的剪切敏感性以及較低的氣泡耐受性，這些特性會對動物細(xì)胞生物反應(yīng)器的設(shè)計產(chǎn)生一定的影響。特別是攪拌與通氣系統(tǒng)的構(gòu)造需要滿足細(xì)胞生長于盡可能優(yōu)化的罐內(nèi)環(huán)境中。只有實現(xiàn)均質(zhì)攪拌，才可避免出現(xiàn)溫度、pH、基質(zhì)和產(chǎn)品濃度梯度的情況；同時，產(chǎn)生的減切力必須小于細(xì)胞的最高耐受。典型的機械攪拌是通過低速螺旋槳葉輪來實現(xiàn)的。氣升式反應(yīng)器中的氣動攪拌，抑或流化床反應(yīng)器中帶外置泵的水力攪拌，也是可以解決細(xì)胞培養(yǎng)所需的均質(zhì)攪拌。為了避免由氣泡帶來的高泡沫和細(xì)胞損壞，可以通過減慢氣體流速、表面通氣或過膜無泡通氣來實現(xiàn)。但是如果減慢了氣體流速，就必須增大氣流中的氧濃度。氧氣、氮氣、空氣和二氧化碳的最佳供應(yīng)量可以通過氣體流量計進行精確調(diào)節(jié)。

動物細(xì)胞培養(yǎng)可以通過有或無細(xì)胞截留的批次、流加和連續(xù)培養(yǎng)方式進行。批次培養(yǎng)的特征在于接種后的細(xì)胞增長是沒有額外培養(yǎng)基的添加。而培養(yǎng)基的限制或有毒代謝物的形成會降低生產(chǎn)率。而我們現(xiàn)在經(jīng)常用到的流加技術(shù)，在接種之后，培養(yǎng)基或其他重要混合物被連續(xù)或逐步加入，乳酸鹽和銨鹽等生長抑制代謝物通過連續(xù)技術(shù)被轉(zhuǎn)移或稀釋，進一步解決了這些問題。但是由于動物細(xì)胞的低生長率和低生產(chǎn)率而導(dǎo)致的生產(chǎn)限制，使得帶有細(xì)胞截留（灌流系統(tǒng)）的連續(xù)培養(yǎng)工藝大受歡迎?，F(xiàn)在我們主要通過適當(dāng)?shù)倪^濾系統(tǒng)，例如轉(zhuǎn)子過濾器或螺旋過濾器來實現(xiàn)細(xì)胞截留。很多哺乳動物細(xì)胞只能附于表面生長。這些貼壁細(xì)胞依附于微載體，微載體的材料可以是：玻璃、纖維素、葡聚糖、膠原蛋白、動物膠或塑膠。有些微載體被設(shè)計成中空的球體，細(xì)胞可以滲入至顆粒內(nèi)部進行生長，從而免受剪應(yīng)力的作用，從而可以提高攪拌速度和通氣量。

現(xiàn)有的動物細(xì)胞生物反應(yīng)器種類很多，根據(jù)攪拌、通氣、滅菌及細(xì)胞截留的不同主要有如下幾種類型：

1 傳統(tǒng)攪拌式細(xì)胞反應(yīng)器

傳統(tǒng)攪拌式細(xì)胞反應(yīng)器是一種攪拌釜反應(yīng)器，專門應(yīng)用于動物細(xì)胞培養(yǎng)，工作體積可以從幾百毫升到幾十立方米。使用螺旋槳葉輪和傳統(tǒng)通氣來實現(xiàn)盡可能小的剪切力。

傳統(tǒng)攪拌式細(xì)胞反應(yīng)器可以進行批次、連續(xù)及流加操作。反應(yīng)器主要用于懸浮動物細(xì)胞培養(yǎng)或微載體培養(yǎng)。連續(xù)培養(yǎng)中，為截留細(xì)胞和提高產(chǎn)能，可以使用轉(zhuǎn)子和螺旋過濾器。而且它的內(nèi)置式取樣裝置可確保傳染性細(xì)胞的無菌取樣，特別適用于病毒疫苗的生產(chǎn)。通過安裝不同的通氣系統(tǒng)，例如底部氣體分布器、表面通氣或硅膠管的無泡通氣，可以滿足不同細(xì)胞的培養(yǎng)需求。

2 氣升式動物細(xì)胞反應(yīng)器

氣升式動物細(xì)胞反應(yīng)器的攪拌是通過氣流來實現(xiàn)的，從而提供更加有效的氧傳遞和低剪切力。為了控制液體循環(huán)，可在中心處插入一個導(dǎo)向泡沫群的同軸通氣管。通過穿孔管、燒結(jié)體或疏水管實現(xiàn)氣體的分布。如果必須避免由氣泡導(dǎo)致的細(xì)胞損害，可通過硅膠管實現(xiàn)無泡通氣，適用于包括昆蟲細(xì)胞在內(nèi)的懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)。從試驗室規(guī)模至大生產(chǎn)規(guī)模，該類反應(yīng)器均可適用?？膳?、流加和連續(xù)操作。

3 流化床動物細(xì)胞反應(yīng)器

流化床動物細(xì)胞反應(yīng)器是一種將載體與懸浮固定化細(xì)胞結(jié)合在一起的生物反應(yīng)器。通常涉及三個相（固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)）。為了細(xì)胞的連續(xù)生長和生產(chǎn)，它采用一種構(gòu)造特殊的分離系統(tǒng)。它由不同的腔室組成，并確保灌注過程中顆粒的完整保留。它通過通氣攪拌，因而剪切力低，并能確保顆粒均勻渦流。氣泡敏感細(xì)胞可以通過硅膠膜實現(xiàn)無泡通氣。通過這種反應(yīng)器可以獲取高密度的 CHO、BHK 和雜交瘤細(xì)胞。流化床動物細(xì)胞反應(yīng)器推薦應(yīng)用于微載體貼壁細(xì)胞、剪切敏感細(xì)胞、包被細(xì)胞以及需長期細(xì)胞培養(yǎng)的分泌物的生產(chǎn)。在流化床動物細(xì)胞反應(yīng)器中，為了方便氣泡敏感細(xì)胞的培養(yǎng)，可使用纖維加固的硅膠管所構(gòu)成的無泡通氣系統(tǒng)，用以避免流向中氧梯度的情況。

4 固定床動物細(xì)胞反應(yīng)器

細(xì)胞和載體被固定于一個固定床中時，可選擇固定床反應(yīng)器進行貼壁細(xì)胞培養(yǎng)。該系統(tǒng)無需特殊的氣、固、液分離裝置，由氣泡產(chǎn)生的剪切力和細(xì)胞損傷是很微弱的。培養(yǎng)期間，富氧培養(yǎng)基在固定床內(nèi)循環(huán)。因為氧氣和培養(yǎng)基的供應(yīng)是不確定的變量，所以對于軸流式固定床而言，床的長度是一個關(guān)鍵性的參數(shù)，在大型固定床動物細(xì)胞反應(yīng)器中使用徑向流灌注有助于解決這一問題。它可連續(xù)或分批收獲濃縮產(chǎn)品和去除廢棄培養(yǎng)基?？捎么祟惙磻?yīng)器進行貼壁細(xì)胞和剪切敏感細(xì)胞的培養(yǎng)。該系統(tǒng)同樣適用于產(chǎn)品是分泌性的長期細(xì)胞的培養(yǎng)。

5 薄膜動物細(xì)胞反應(yīng)器

薄膜動物細(xì)胞反應(yīng)器包含一個內(nèi)腔室和一個外腔室，它們被一層透析膜隔開。這層薄膜支持灌注培養(yǎng)中的無泡通氣和細(xì)胞保留。運用了膜技術(shù)后，有毒的（低分子）代謝物被清除，（高分子）產(chǎn)物被保存在內(nèi)腔室中。每個腔體內(nèi)的攪拌是由一個攪拌器來進行的。培養(yǎng)基和空氣進入外腔室。反應(yīng)器適用于灌注工藝，同時也可用于批次、流加工藝。可以使用此類反應(yīng)器進行懸浮細(xì)胞和附于微載體的貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)。

6 結(jié)語

介紹完了主要的幾種動物細(xì)胞反應(yīng)器，有必要提一下細(xì)胞反應(yīng)器中的重要組件，即用于細(xì)胞截留及提高產(chǎn)率的灌注過濾系統(tǒng)，它主要有兩種實現(xiàn)方式：

⑴轉(zhuǎn)子過濾器：轉(zhuǎn)子過濾器是以旋轉(zhuǎn)篩技術(shù)為基礎(chǔ)的。

可直接將其安裝于生物反應(yīng)器的罐內(nèi)或單獨作為一個外置旁路系統(tǒng)。內(nèi)置的好處是系統(tǒng)結(jié)構(gòu)緊湊；外置的優(yōu)點是靈活性高，因為在培養(yǎng)期內(nèi)可以將其單獨拆卸、清洗、滅菌并再次使用。該裝置可以保證在大規(guī)模連續(xù)培養(yǎng)中實現(xiàn)極佳的細(xì)胞截留率（≥ 80%）。

⑵螺旋過濾器：螺旋過濾器是以膜分離技術(shù)為基礎(chǔ)的。它著眼于高通量和低能耗的實現(xiàn)。一個旁路系統(tǒng)將螺旋過濾器與生物反應(yīng)器相連接，可在位滅菌或高壓鍋內(nèi)滅菌。因為剪切力很小，所以非常適用于細(xì)胞截留和無細(xì)胞取樣。

現(xiàn)代動物細(xì)胞反應(yīng)器的發(fā)展日新月異，它的不斷發(fā)展源于生物制藥產(chǎn)業(yè)的新工藝、新材料、新檢測手段、新質(zhì)控要求、新成本要求、新自動化控制策略等的大力推動?；A(chǔ)扎實才能不斷推陳出新，希望我國能在動物細(xì)胞反應(yīng)器的硬件、軟件、工藝等多個方面打好基礎(chǔ)，在動物細(xì)胞反應(yīng)器的研發(fā)、生產(chǎn)及應(yīng)用方面走在世界的前列。

戴曉云，Email：xydai@bioengineering.com.cn

2010-01-20

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2010.02.017