張振杰，崔麗娜，張元鵬，趙 協(xié)，王 亮，常維山

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東 泰安 271018)

假型病毒(Pseudotyped virus)是利用現(xiàn)代生物技術(shù)人工合成的一種病毒，它與真病毒相比不僅囊膜上具有其他病毒的糖蛋白，而且核酸分子上編碼囊膜蛋白的基因被刪除，所以這種病毒只能進(jìn)行“一個細(xì)胞周期”的侵染，在慢病毒表達(dá)高度發(fā)展基礎(chǔ)上[1]，確保了假型病毒的生物安全性。一般在研究傳染性強和不易體外培養(yǎng)的病毒囊膜蛋白的功能和性質(zhì)時，制備假型病毒是一種行之有效的方法。假型病毒可以模擬真病毒的侵染，它的應(yīng)用一定程度上避免了高致病性病毒的傳播和擴散，在病毒學(xué)研究方面顯示出許多優(yōu)勢。另外，具有復(fù)制功能和非競爭性的假型病毒載體能夠在體外高效地轉(zhuǎn)移靶基因于哺乳動物細(xì)胞，并且假型病毒宿主范圍廣、轉(zhuǎn)染效率高、滴度高[2]、不易被血清補體滅活。因此假型病毒不僅可以用來研究病毒與宿主細(xì)胞的相互作用，鑒定病毒受體，更重要的是可以用于篩選抗病毒藥物、測定患者體內(nèi)中和抗體的效價、評價疫苗臨床免疫的效果和作為基因治療工具。

1 假型病毒的制備

1.1 假型病毒載體的特點 假型病毒的核酸骨架大多是經(jīng)過基因修飾的逆轉(zhuǎn)錄病毒核衣殼基因，如艾滋病病毒、小鼠白血病病毒等。將基因組中的順式調(diào)節(jié)元件(ψ包裝信號，LTR長末端重復(fù)序列)和編碼env囊膜蛋白的基因進(jìn)行調(diào)整和分離，構(gòu)建的載體具有最小輔助包裝元件特點，去除了基因結(jié)構(gòu)中不同輔助元件或用其它特異序列代替，敲除對病毒體外復(fù)制不重要但具有致病性的基因(如nef，vif，vpr等)，減少了病毒的序列數(shù)量?；蚪M3'LTR的U3區(qū)的一部分被刪除，這一部分區(qū)域包含了TATA框，以及一些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合部位。在病毒RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄的時候，刪除了U3區(qū)的3'LTR成為了5'LTR，由于其缺少了增強子以及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合部位，導(dǎo)致了病毒RNA不能轉(zhuǎn)錄，降低同源重組的風(fēng)險，因此該系統(tǒng)更加安全。目前新一代慢病毒載體例如人獲得性免疫缺陷病毒/水泡性口炎病毒(HIV/VSV)假型病毒系統(tǒng)在前四代慢病毒載體基礎(chǔ)上增加了兩個基因元件旱獺轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(WPRE)和聚嘌呤區(qū)(CPPT)。WPRE來自旱獺肝炎，與目的基因片段的下游區(qū)相連接，提高目的基因表達(dá)量[3]。CPPT來自HIV-I剪切酶基因，能夠增加插入靶細(xì)胞染色體的慢病毒拷貝數(shù)[4]，并且提高病毒滴度。WPRE和CPPT兩個基因連接后，在大多數(shù)種類細(xì)胞中至少提高4倍蛋白質(zhì)量的表達(dá)，還可以通過綠色熒光蛋白報告基因的表達(dá)準(zhǔn)確地測定假型病毒的滴度。同時C-末端插入V5標(biāo)簽便于純化表達(dá)蛋白。

1.2 假型病毒制備的一般流程 制備假型病毒時，首先將目的基因插入異源啟動子的多克隆位點，構(gòu)建好的載體連同包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞293T，細(xì)胞培養(yǎng)48 h，超速離心收獲病毒復(fù)制缺陷型假型病毒，其滴度可達(dá)10×109u/mL。VSV-G糖蛋白的使用在假型病毒基因送遞中克服了宿主范圍狹窄的缺陷[5-7]，如果插入其它囊膜蛋白基因，則可代替表達(dá)囊膜的包裝質(zhì)粒(PLP/VSVG)，可用于篩選自然宿主。表達(dá)載體攜帶J亞群禽白血病(ALV-J)的囊膜蛋白env基因(gp85和gp37)，目的蛋白在胞漿內(nèi)表達(dá)后在信號肽的引導(dǎo)下定位到包裝細(xì)胞的細(xì)胞膜表面，然后病毒以出芽生殖從胞漿內(nèi)釋放出來，新生的HIV/ALV-J病毒顆粒就攜帶ALV-J囊膜蛋白，具有ALV-J抗原特性，可以建立ALV-J體外中和試驗，并初步應(yīng)用于評價ALV-J感染雞群中和抗體水平，同時模擬ALV-J早期感染過程來研究病毒與靶細(xì)胞間的相互作用等。自從Lagging等制備了VSV/HCV假型病毒，目前又有幾種假型病毒侵染系統(tǒng)已經(jīng)成功的建立，如鼠白血病病毒(MuLV)/豬瘟病毒(CSFV-E)、VSV-G/MuLV、HIV/H5N1(禽流感)-HA 等[8]。

2 假型病毒的應(yīng)用

2.1 研究病毒與宿主細(xì)胞間的相互作用 利用假型病毒不僅能研究病毒的細(xì)胞嗜性和進(jìn)入過程，還可以確定病毒的易感細(xì)胞和特異受體。研究病毒的進(jìn)入過程具有以下優(yōu)點：安全；外膜蛋白容易人為改造和檢測；假型病毒因攜帶報告基因進(jìn)入細(xì)胞的過程容易量化便于觀察；由于假型病毒的外膜蛋白與核酸來自兩種不同的病毒，因而可以將病毒的進(jìn)入過程與復(fù)制過程明確分開；可以篩檢特異性抑制病毒進(jìn)入的化學(xué)性和免疫性物質(zhì)[1]。

病毒受體的特異性決定了病毒的細(xì)胞嗜性及引起的疾病，病毒與其細(xì)胞受體的相互作用為抗病毒感染的抗體和藥物的研究提供了重要的依據(jù)。利用假型病毒來研究豬瘟病毒(CSFV)在受體特性和組織嗜性上的變異，例如研究CSFV囊膜糖蛋白與病毒組織嗜性關(guān)系及糖蛋白結(jié)合受體的特性。通過擴增CSFV的囊膜蛋白基因,構(gòu)建具有感染性的MuLV/CSFV-E假型病毒體系，形成假型病毒顆粒，單獨研究E0或E2囊膜蛋白在細(xì)胞侵入中的功能，然后經(jīng)過免疫印跡檢測E012蛋白在假型病毒顆粒表面得到表達(dá)，而且形成的假型病毒MuLV-E012能夠感染豬源細(xì)胞，表明在細(xì)胞表面存在CSFV的受體[9]。這些研究為篩選和評價在病毒復(fù)制早期起作用的抗病毒藥物提供了大量依據(jù)。還可以研究病毒對外源基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)能力，構(gòu)建攜帶CMV-EGFP報告基因表達(dá)元件的重組病毒Lenti-EGFP，通過離心轉(zhuǎn)導(dǎo)分析對29種不同來源的哺乳動物細(xì)胞株的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)及表達(dá)效率，結(jié)果顯示重組病毒對懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移效率相對低于貼壁培養(yǎng)細(xì)胞，基因的表達(dá)效率不完全與轉(zhuǎn)移效率成正比。表明外源基因的導(dǎo)入靶細(xì)胞和表達(dá)效率受多種因素的影響[10]。張松林等將高致病性禽流感病毒(AIV)H5N1亞型HA蛋白整合到HIV顆粒，包裝成表達(dá)HA蛋白的假病毒粒子(HIV/H5-HA)，并對所包裝的假病毒的生物學(xué)功能進(jìn)行了研究[11]。結(jié)果表明，HIV/H5-HA與天然的禽流感病毒相似，具有廣泛的細(xì)胞嗜性；能夠凝集雞紅細(xì)胞，并且pH值依賴性測定表明，HA假病毒需要低pH值才能實現(xiàn)正確的入侵宿主細(xì)胞。同時假病毒模型的建立為進(jìn)一步研究AIV與宿主之間的免疫應(yīng)答提供了一種新的途徑。

2.2 中和抗體及中和抗原表位研究 利用假型病毒進(jìn)行中和抗體檢測和抗原表位研究，同傳統(tǒng)的檢測方法相比具有明顯的技術(shù)優(yōu)勢，如安全性、快速性、標(biāo)準(zhǔn)化、高通量和高度敏感性[7]，另外對于難以培養(yǎng)的、高致病性的病毒的研究也具有明顯的優(yōu)勢。因此已經(jīng)在AIV、HIV、CSFV及丙型肝炎(HCV)等病毒表面抗原研究中擁有廣泛的應(yīng)用。

在進(jìn)行不同HIV候選疫苗的免疫評價時，因為沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)參考病毒株，因此難以評價不同HIV疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體的交叉中和作用[12]。從急性和早期的B亞型HIV感染者中克隆gp160全長基因，經(jīng)過功能性篩選后，制成假型病毒，作為標(biāo)準(zhǔn)參考物來評價不同疫苗所產(chǎn)生的中和抗體的效價[12]。Lee等利用制備的VSVΔGHTN假型病毒免疫BALB/c小鼠，在所有的小鼠中都沒有檢測到針對核衣殼蛋白的結(jié)合抗體，也沒有檢測到漢坦病毒HTNV特異的CD8+T細(xì)胞反應(yīng)，表明誘導(dǎo)產(chǎn)生的中和抗體能很好保護(hù)小鼠抵抗病毒感染，這是VSV假型病毒作為一種病毒顆粒疫苗的第一次成功應(yīng)用[13]。

利用相對安全的HCV假型病毒模型不僅為我們在體外評估不同基因工程疫苗所誘導(dǎo)的抗HCV中和抗體及其在免疫保護(hù)中的作用提供了技術(shù)基礎(chǔ)，而且是目前最為經(jīng)濟(jì)有效的手段。利用建立的分別攜帶H77(1a)、HeBei(1b)及J FH-1(2a)的3種不同基因型HCVE1-E2包膜蛋白的假型病毒顆粒，建立HCV體外中和試驗方法，應(yīng)用于評價HCV慢性感染者體內(nèi)中和抗體水平。這些研究為進(jìn)一步優(yōu)化免疫原，探索最佳的疫苗組合與免疫策略，以及評價中和抗體在HCV感染和疾病進(jìn)程中的作用，提供有力的技術(shù)支持[14]。

在研究中和抗原表位方面，可以通過構(gòu)建攜帶乙肝病毒(HBV)抗原蛋白preS2S基因的重組MVA假型病毒顆粒，評價HBV的抗原性。將HBV-preS2S基因構(gòu)建入MVA，得到重組假型病毒顆粒，表達(dá)的preS2S蛋白能夠被抗HBsAb識別，具有良好的抗原性，為基因治療HBV慢性感染做了一項實驗性奠基工作[15]。閆克夏等應(yīng)用高效表達(dá)SARS-CoV S蛋白的HIV慢病毒質(zhì)粒及3個包裝質(zhì)粒載體系統(tǒng)共同轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞293T，包裝了SARS假病毒，通過SARS假病毒感染的RD-A細(xì)胞中標(biāo)記基因EGFP表達(dá)的分析，確定SARS假病毒能有效進(jìn)入細(xì)胞，建立了可在生物2級實驗室可操作的SARS病毒中和試驗技術(shù)平臺[16]。

2.3 基因治療 逆轉(zhuǎn)錄病毒的許多特點使其成為基因轉(zhuǎn)移載體的最佳選擇之一。最重要的一點是它可以有效的整合于動物靶細(xì)胞基因組并穩(wěn)定持久地表達(dá)所帶的外源基因。病毒基因組以轉(zhuǎn)座的方式整合，基因組不會發(fā)生重排，因此所攜帶的外源基因也不會改變。如果能實現(xiàn)有效的基因轉(zhuǎn)移，基因治療在對付動物遺傳性疾病、減緩腫瘤發(fā)展、克服病毒性感染等方面都會有廣闊的應(yīng)用前景。這就要求在載體改造、載體的靶向性、外源基因的表達(dá)調(diào)控等諸多方面取得顯著進(jìn)展。用假型病毒作為轉(zhuǎn)基因載體治愈效率高，而且比反轉(zhuǎn)錄病毒載體更有效抵抗血清補體滅活的作用，所以假型病毒應(yīng)用于基因治療實驗成功的例子很多。首先是采用HIV作為基因治療載體，它最大的特點是非細(xì)胞周期依賴的整合特性，可以高效地轉(zhuǎn)染許多靜止的細(xì)胞如神經(jīng)元細(xì)胞、造血干細(xì)胞、肝細(xì)胞等，使以這些細(xì)胞為靶細(xì)胞的體內(nèi)基因治療成為可能。

近年來興起的基因治療，為腫瘤治療開辟了嶄新的領(lǐng)域。胸苷激酶(TK)對人胃癌細(xì)胞有殺傷作用，應(yīng)用PA317細(xì)胞包裝的逆轉(zhuǎn)錄病的介導(dǎo)的單純皰疹病毒(HSV)TK基因系統(tǒng)成為人類胃癌體內(nèi)基因治療計劃，逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的酶藥物預(yù)施療法被認(rèn)為可能是最有潛力的方法。王毅等采用缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的HSV-TK基因系統(tǒng)體外轉(zhuǎn)染MKN28人胃癌細(xì)胞株，體外以病毒上清感染法將TK基因?qū)隡KN28人胃癌細(xì)胞，然后整合入細(xì)胞基因組，同時觀察協(xié)同作用的更昔洛韋(GCV)對轉(zhuǎn)染TK基因的胃癌細(xì)胞的殺傷作用[17]。結(jié)果只有10%～20%的TK基因陽性胃癌細(xì)胞存在，在有效濃度GCV治療后能殺傷大部分混合細(xì)胞。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體攜帶自殺基因HSV-TK系統(tǒng)用于腫瘤的治療已進(jìn)行了大量的實驗，體外轉(zhuǎn)染有基因表達(dá)持久而穩(wěn)定的特點。特別是對腦膠質(zhì)瘤的治療已進(jìn)入了臨床試驗階段，而且在卵巢癌腹膜種植的動物實驗中也取得了很好的效果。RNA干涉(RNAi)是最近發(fā)展起來能特異性抑制哺乳動物細(xì)胞中基因表達(dá)的新技術(shù)，特別是由某些蛋白過量表達(dá)引起的疾病如腫瘤以及病毒感染等的基因治療上具有的良好應(yīng)用前景，程聯(lián)勝等首次構(gòu)建了基于RNAi的慢病毒載體，該病毒攜帶針對腫瘤表面抗原HER2的siRNA表達(dá)盒并且具有抑制高表達(dá)HER2細(xì)胞生長的特異性，有效地下調(diào)腫瘤抗原HER2的表達(dá)[18]。應(yīng)用于半月板的治療，張經(jīng)緯等利用ViraPower慢病毒載體系統(tǒng)有效地將堿性成纖維細(xì)胞生長因子基因轉(zhuǎn)染入半月板纖維軟骨細(xì)胞，繼而促進(jìn)半月板細(xì)胞的增殖和基質(zhì)合成，有可能為治療半月板損傷提供新的方法[19]。應(yīng)用于傳染性疾病的基因治療，如假型病毒作為基因載體可攜帶多種基因轉(zhuǎn)導(dǎo)HIV-1易感細(xì)胞，表達(dá)抗HIV-1基因，阻斷或抑制病毒進(jìn)入靶細(xì)胞。理論上只要阻斷受體，將有效阻止HIV-1的入侵。構(gòu)建慢病毒載體Plenti6/V5-R-K攜帶CC趨化因子，轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)后搶先占領(lǐng)HIV-1受體CCR5，迅速導(dǎo)致受體不可逆的內(nèi)陷化，阻斷HIV-1與受體的結(jié)合，進(jìn)而阻斷與靶細(xì)胞的附著和融合，顯示出部分抵抗HIV感染的能力，延緩AIDS的進(jìn)程，這為假型病毒用于艾滋病的基因治療提供了新的思路[20]。

3 問題與展望

諸多的優(yōu)點使假型病毒在病毒學(xué)的研究和基因治療方面成為近年來的研究熱點，但作為一種新型的基因治療手段，其從基礎(chǔ)研究到臨床應(yīng)用尚需要大量科學(xué)研究。此外，假型病毒技術(shù)也存在著許多缺點，例如基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的安全性、靶向性和有效性問題，它們之間是相輔相成的3個方面，在基因治療中自然應(yīng)三者兼顧。提高逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染率，可通過重復(fù)感染方法，多次將包裝細(xì)胞注射到病灶周圍，使其不斷產(chǎn)生假型病毒顆粒以感染病灶細(xì)胞。另外，改變表面env蛋白可以改變載體的靶向性，如用VSV的G蛋白包裝逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組產(chǎn)生假型病毒，可拓展靶細(xì)胞范圍并賦予病毒顆粒新的特性。利用組織特異性的啟動子限制也可以實現(xiàn)目的基因表達(dá)的靶向性；采用基因重組來控制轉(zhuǎn)錄因子，也可控制目的基因表達(dá)的時間和表達(dá)的水平。簡便、安全、高效和穩(wěn)定表達(dá)，是衡量假型病毒基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的重要標(biāo)準(zhǔn)和客觀指標(biāo)。隨著分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的發(fā)展，以及假型病毒自身的完善，期望基因治療會有一個美好的前景，實現(xiàn)真正的臨床突破，推動我國畜牧業(yè)的發(fā)展，達(dá)到基因治療造福人類的最終目的。

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