金秧敏,王春花,王鑫瀅,張秀英

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,黑龍江哈爾濱150030)

病毒感染性疾病一直是威脅人類健康的世界性難題,也是動(dòng)物常發(fā)的主要疾病。這是因?yàn)橐环矫娌《疽装l(fā)生多種變異,而且它們完全依賴感染的宿主細(xì)胞增殖和存活,另一方面作為抗病毒藥物所必須具備的最重要的條件是對(duì)細(xì)胞內(nèi)的病毒有抑制作用,而對(duì)細(xì)胞的正常代謝無影響使得開發(fā)有效的針對(duì)病毒感染的治療制劑存在諸多困難,至今仍然沒有有效治療藥物,目前多用核苷類似物用于病毒性疾病的治療,然而這些藥物存在諸多問題：對(duì)細(xì)胞的毒副作用,抗藥變異株的出現(xiàn),對(duì)與宿主細(xì)胞基因組整合的病毒以及對(duì)潛伏病毒感染的治療有一定困難等[1]?？傊共《舅幬镅芯窟€未取得突破性進(jìn)展。鑒于病毒感染危害的嚴(yán)重性和廣泛性,人們更關(guān)注開發(fā)新的、具有不同作用機(jī)制、且毒副作用較小的抗病毒制劑。

多糖作為一類重要的天然生物活性物質(zhì),具有無細(xì)胞毒性且質(zhì)量通過化學(xué)手段容易控制等優(yōu)點(diǎn),已成為當(dāng)今新藥的發(fā)展方向之一。但天然藥物的藥效相對(duì)較低,通過分子修飾的方法可以提高其功效。其中硫酸化修飾是近年來多糖結(jié)構(gòu)修飾的重要方向之一。近年的研究已經(jīng)證實(shí),多種多糖經(jīng)硫酸化修飾后,會(huì)使其具有或加強(qiáng)抗病毒活性。

1 多糖的硫酸化修飾方法

多糖的硫酸化反應(yīng)原理是在路易斯堿溶液中由SO3 H+取代多糖羥基中的H+,經(jīng)中和而得的多糖硫酸鹽。主要方法有濃硫酸法、三氧化硫-吡啶法,Nagasawa方法,氯磺酸-吡啶法和氯磺酸-甲酰胺法。濃硫酸法和三氧化硫-吡啶法由于其酯化程度和回收率不高,因此現(xiàn)在應(yīng)用較少。

Nagasawa方法：呋喃型多糖常采用此法。多糖溶于二甲基亞砜中,加入哌啶-N-磺酸,混和物加熱反應(yīng),再加入飽和碳酸氫鈉溶液,透析,濃縮,冷凍干燥后即得硫酸酯化的呋喃型多糖。

氯磺酸-吡啶法：即Wolfrom 方法,用氯磺酸與吡啶的混合物作為硫酸酯化試劑對(duì)多糖進(jìn)行硫酸酯化。此法試劑簡單易得,反應(yīng)條件相應(yīng)地簡單,產(chǎn)物回收方便,回收率和取代度均較理想。但是該試劑在冷藏下只保存一周,不過最好新鮮制備。

氯磺酸-甲酰胺法：此方法與氯磺酸-吡啶法類似,不同之處只是先將多糖溶解在甲酰胺中,這樣有利于多糖的溶解,能提高硫酸酯多糖的回收率。

2 影響硫酸酯多糖抗病毒活性的主要因素

2.1 硫酸基團(tuán) 硫酸基的引入會(huì)引起多糖理化性質(zhì),特別是立體構(gòu)象的變化,而構(gòu)象變化恰恰是活性變化的決定因素。研究發(fā)現(xiàn),有的多糖本來無抗病毒活性,經(jīng)硫酸化后表現(xiàn)出抗病毒活性,例如小分子量的牛膝多糖有增強(qiáng)免疫的作用,但無抗病毒活性,若引入一定量的硫酸基團(tuán)后,就有較強(qiáng)的抑制乙型肝炎病毒HBsAg、HBeAg表達(dá)以及抗單純皰疹病毒I型的活性[2]。相反的,有抗病毒活性的硫酸酯多糖被脫去硫酸根后,即降低或失去抗病毒活性,例如,肝素鈉N-脫硫酸化及O-脫硫酸化都會(huì)降低其抗病毒活性,說明其抗病毒活性不僅依賴于負(fù)電荷,而且特定的結(jié)構(gòu)參與了抗病毒活性的生成,尤其是O-脫硫酸化顯得極為重要[3]。

另一方面,硫酸基取代度,即每二糖單位中的硫酸基數(shù)量,是影響肝素等硫酸多糖抗病毒作用的一個(gè)重要因素。試驗(yàn)表明,多糖硫酸酯的作用與其取代度在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān)[4],以D-葡萄糖和D-半乳糖為側(cè)鏈的纖維素和支鏈纖維素硫酸酯化后,可表現(xiàn)出抗HIV活性,而且其抗HIV活性隨硫酸基團(tuán)取代度的增加而增強(qiáng)。一般來說,硫酸根含量在每個(gè)糖殘基平均為1.5～2.0時(shí)最佳。

2.2 分子量 硫酸酯化多糖的抗病毒作用與分子量的大小有很大的關(guān)系。但不同多糖發(fā)揮抗病毒作用的最佳分子量各不相同,其抗病毒活性隨著大于或小于該分子量而迅速降低。如硫酸葡聚糖抗HIV病毒活性隨著相對(duì)分子質(zhì)量的增加而增加,相對(duì)分子質(zhì)量10 000時(shí)達(dá)到最大,在10 000～500 000之間保持最大活性,分子量再增加則其抗病毒活性將會(huì)下降[5]。右旋糖酐酯化后,其分子量在5 000～50 000之間時(shí),抗 HIV活性隨分子量增大而增強(qiáng)[6]。高分子量的硫酸多糖即使在比較高的濃度也沒有表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性,而對(duì)多種包膜病毒顯示出其抗病毒活性;一般來說中等分子量多糖的抗病毒活性大于高分子量及低分子量的多糖。

2.3 化學(xué)結(jié)構(gòu) 多糖經(jīng)硫酸化修飾后,分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,其空間結(jié)構(gòu)也發(fā)生變化,其抗病毒活性也會(huì)隨之變化。沃爾默特認(rèn)為,許多糖單位的氫基被SO-3基團(tuán)取代后,糖環(huán)構(gòu)象可能扭曲或轉(zhuǎn)變并利于形成非共價(jià)鍵,而且?guī)噪姾苫鶊F(tuán)間的相互排斥作用導(dǎo)致卷曲構(gòu)象呈伸展和剛性狀態(tài)。當(dāng)多糖環(huán)被硫酸基修飾,這些陰離子基團(tuán)間的排斥作用使糖鏈鏈段伸長;而且部分硫酸基可能會(huì)和糖環(huán)上的羧基形成氫鍵,因而在糖鏈局部可能形成了螺旋結(jié)構(gòu),呈有活性的高級(jí)構(gòu)象,且有序性增大。因此,當(dāng)多糖的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化時(shí),其抗病毒活性發(fā)生相應(yīng)的改變[7]。

3 硫酸酯化多糖的抗病毒作用

綜合目前國內(nèi)外研究來看,多糖對(duì)艾滋病病毒、皰疹病毒及流感病毒等具有良好的抑制作用,且具有活性的多為硫酸多糖。經(jīng)人工硫酸化修飾可使原來不含有硫酸根或硫酸根含量低的多糖表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗病毒活性[8]。

自1987年發(fā)現(xiàn)硫酸酯化葡聚糖具有抑制人類免疫缺陷病毒(HIV)活性以來,人們對(duì)這類多聚陰離子化合物產(chǎn)生了極大興趣和關(guān)注,特別是關(guān)于該類多糖的抗病毒研究十分活躍,它有可能成為繼HIV逆轉(zhuǎn)錄酶活性抑制劑(RTIs)、蛋白酶抑制劑(PIs)和融合酶抑制劑(INIs)之后又一類潛在的新型抗HIV藥物。

辛現(xiàn)良等[9]從南海多種海藻硫酸化多糖中篩選和分子修飾得到的聚甘古酯-海洋硫酸多糖911,其重均分子量為6 000,在體內(nèi)外均可抑制HIV-1的增殖,是一種高效的新型抗HIV-1海洋藥物。于囡等[10]從海洋貝類扇貝裙邊中提取、純化得到的酸性粘多糖(SS-GAG)-扇貝裙邊糖胺聚糖具有很強(qiáng)的抗單純皰疹病毒的作用。SS-GAG不同濃度均能有效保護(hù)經(jīng)HSV-I感染的Vero細(xì)胞和宮頸癌(Hela)細(xì)胞,使細(xì)胞活性增強(qiáng);并減弱HSV-I導(dǎo)致的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE),抑制病毒的復(fù)制,阻斷HSV-I對(duì)細(xì)胞的侵入,但沒發(fā)現(xiàn)其對(duì)病毒的直接殺傷作用。盧宇等[11]從淫羊藿葉中分離純化得到淫羊藿多糖,按正交試驗(yàn)設(shè)定氯磺酸-吡啶法的9種修飾條件,對(duì)淫羊藿多糖進(jìn)行硫酸化修飾,得到9種硫酸化淫羊藿多糖,試驗(yàn)證明其抗雞傳染性腔上囊病毒的能力均有不同程度的提高,且其能力與硫酸基取代度和糖含量有一定的相關(guān)性。

4 硫酸酯多糖的抗病毒作用機(jī)制

一般認(rèn)為,多糖的抗病毒機(jī)制是對(duì)病毒復(fù)制早期階段進(jìn)行抑制,有研究資料表明,硫酸酯化多糖的主要抗病毒機(jī)制可能是硫酸基團(tuán)的負(fù)電荷與病毒上蛋白的正電荷通過靜電作用結(jié)合,進(jìn)而阻止了病毒對(duì)細(xì)胞的吸附,封閉了包膜病毒與細(xì)胞受體結(jié)合的部位。雖然病毒種類不同,但抗病毒的機(jī)制類似。

4.1 抗艾滋病病毒(HIV)的作用機(jī)制 硫酸酯多糖首先通過干擾HIV與宿主細(xì)胞的吸附而發(fā)揮作用。硫酸酯多糖是陰離子多聚體,帶有負(fù)電荷,可與HIV-1的外殼糖蛋白gp120上帶正電荷的的V3環(huán)區(qū)域結(jié)合,使病毒顆粒不能與CD4+細(xì)胞結(jié)合。另外由于它在結(jié)構(gòu)上和細(xì)胞表面的糖胺聚糖相類似,能以競(jìng)爭(zhēng)性抑制的方式來阻止病毒與細(xì)胞的結(jié)合,形成無感染的硫酸酯多糖-病毒復(fù)合物;同時(shí)它還是CD4+細(xì)胞表面分子的模擬配體,能夠直接與T細(xì)胞表面受體結(jié)合,阻礙病毒與CD4+細(xì)胞的吸附過程[12]。

硫酸酯多糖的抗HIV病毒作用還可通過抑制逆轉(zhuǎn)錄酶活性來影響病毒的逆轉(zhuǎn)錄過程,已經(jīng)有體外試驗(yàn)證明,硫酸酯化多糖能有效抑制HIV-1的逆轉(zhuǎn)錄酶活性,未硫酸化的多糖幾乎沒有這種作用。有學(xué)者認(rèn)為,硫酸酯多糖分子中的硫酸化側(cè)鏈與RNA模板引物上的某些酶具有相同的結(jié)合位點(diǎn),從而產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用[13]。但究竟是通過何種機(jī)制來影響病毒的逆轉(zhuǎn)錄過程目前還不清楚,有待進(jìn)一步的研究來闡明。

4.2 抗單純皰疹病毒(HSV)的作用機(jī)制 對(duì)于HSV有報(bào)道認(rèn)為硫酸酯化多糖可與HSV中的糖蛋白C(gC)競(jìng)爭(zhēng)性的抑制細(xì)胞表面受體分子硫酸乙酰肝素(HS)[14],主要通過與病毒糖蛋白上帶正電荷的富精氨酸區(qū)域結(jié)合來阻止病毒與細(xì)胞結(jié)合。主要是因?yàn)榱蛩狨セ嗵鞘且活惗嗑坳庪x子,帶有負(fù)電荷能與病毒包膜糖蛋白上的正電荷結(jié)合,導(dǎo)致這些區(qū)域的屏蔽作用,從而阻止病毒與細(xì)胞結(jié)合。

4.3 抗流感病毒(IFV)的作用機(jī)制 硫酸酯多糖可阻止IFV中糖蛋白血凝素與宿主細(xì)胞膜表面多糖受體末端的N-乙酰神經(jīng)氨酸結(jié)合,阻止使病毒附著于易感細(xì)胞表面[15]。廖灶輝等[16]從海洋藻類龍須菜中提取多糖,并證明龍須菜硫酸化多糖可以通過干擾病毒對(duì)宿主細(xì)胞的吸附,抑制病毒的復(fù)制實(shí)現(xiàn)其抗流感病毒的作用。且證明其抗病毒能力在硫酸根含量為13.25%,DS為1.16時(shí)其抗病毒作用最好。

5 硫酸酯多糖抗病毒作用的應(yīng)用前景

隨著對(duì)天然藥物認(rèn)識(shí)的不斷加強(qiáng),海洋藥物抗病毒活性的研究越來越受國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。目前中國已從海洋有機(jī)體中提取了一種硫酸化多糖,即硫酸多聚甘露醛酸多糖(SPMG),作為用于治療AIDS獲得性免疫缺陷綜合征,又稱艾滋病的候選藥物已經(jīng)進(jìn)入臨床Ⅱ期試驗(yàn)階段[5]。SPMG主要是通過其特殊位點(diǎn)與CD4分子陽性細(xì)胞結(jié)合,以此來介導(dǎo)在AIDS感染者中的抗病毒作用,有望不久后用于AIDS的治療,為有效治AIDS發(fā)揮積極的作用。

硫酸酯化多糖作為新型抗病毒藥物的研究已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展,相信隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步、新研究方法的應(yīng)用、對(duì)硫酸酯化多糖構(gòu)效關(guān)系認(rèn)識(shí)的加深以及對(duì)硫酸酯化多糖抗病毒作用機(jī)制的不斷闡明,相信將有更多新的高活性低毒性的硫酸酯化多糖用于臨床抗病毒治療中。

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