張 祎 魏素菊 韓文峰

(河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院,河北 石家莊 050011)

研究者發(fā)現(xiàn)腫瘤干細胞(CSC)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、復發(fā)及轉移過程中發(fā)揮著重要作用。CSC是存在于腫瘤組織中具有干細胞樣能力的腫瘤細胞亞群,一個CSC能夠產生整個腫瘤組織的(處于不同分化階段的)所有腫瘤細胞〔1〕。CSC概念的提出為研究腫瘤細胞的生物學特性提供了新思路,并為腫瘤的臨床治療提供了新靶點,目前已逐漸成為腫瘤防治研究的新的熱點。

1 CSC的起源

①干細胞:目前已經公認白血病是由帶有白細胞分化抗原(CD)CD96+、CD34+、CD38-標記的白血病干細胞引起的惡性腫瘤〔2〕。 ②成熟體細胞:Cocciadiferro等〔3〕通過研究干細胞標志物胚胎干細胞相關蛋白(Oct-4)、zeste基因 12抑制劑(SUZ-12)和表皮生長因子(EGF)家族成員(Cripto-1)在雄激素反應型 LNCaP和非反應型PC3細胞系中的表達認為前列腺癌CSC可能來源于已分化的成熟細胞。③CSC異常的細胞融合產生的雜交細胞。④靜止的胚胎干細胞:人們發(fā)現(xiàn)在很多CSC中表達一些胚胎干細胞的標記基因如胚胎干細胞相關蛋白、HMG盒轉錄因子(Sox2)等〔4〕。⑤與病毒有關:Chaudhary博士認為病毒可促進變異細胞群進一步生長和復制,最終完全癌變〔5〕。⑥與骨髓來源的細胞有關:近期研究表明,胃癌的 CSC起源于骨髓來源的細胞〔6〕。

2 CSC生成的調節(jié)

2.1 微環(huán)境與CSC的發(fā)生 微環(huán)境可以決定干細胞的分化方向?；チ黾毎⑷胧竽遗邇燃毎麍F可以形成正常胚胎。基因型正常的胚胎干細胞向同系小鼠腹腔移植可產生極度惡性的腫瘤。

2.2 細胞周期調節(jié)因子與 CSC的發(fā)生 Yuan等〔7〕在進行細胞周期調節(jié)因子 p18完全缺失的造血細胞重建試驗后發(fā)現(xiàn)此細胞具有更強的自我更新能力,而且在干細胞水平沒有向白血病細胞轉化,但一小部分接受移植的鼠出現(xiàn)了急性T淋巴細胞白血病,但白血病的發(fā)展伴隨抑癌蛋白 p15或 p16基因啟動子區(qū)的甲基化及細胞周期調節(jié)因子p18基因的缺失,且從這些發(fā)生白血病的小鼠中分離的造血干細胞不會將白血病的表型轉移到別的受體鼠,表明細胞周期調節(jié)因子p18下調造成干細胞自我更新加強后不足以引起白血病發(fā)生,但抑癌蛋白 p15或p 16破壞后可能促進了白血病干細胞的形成并影響正常造血過程的進行。

3 CSC的識別、分離與鑒定

CSC的識別、分離與鑒定是目前研究重點?；趯φ８杉毎恼J識,且因CSC表面標記(膜蛋白、黏附分子及受體等)與一般腫瘤細胞不同,可使用正常干細胞標記物,采用流式細胞儀或免疫磁珠法進行分選。正常干細胞標記物有巢蛋白、白細胞分化抗原 CD133等。Beier等〔8〕發(fā)現(xiàn)人腦膠質瘤組織中腦CSC的表面標志物為 CD133+。Eramo等報道,注射 104個只占肺癌組織 0.32%～1.13%的CD133+的細胞,可在重度聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠中形成移植瘤,實驗還證實 CD133+細胞在含上皮生長因子的無血清培養(yǎng)基中形成瘤球,具有多向分化和自我更新能力,認為CD133可作為肺癌干細胞標志物,他們還也發(fā)現(xiàn)肺癌干細胞屬于 CD133+細胞〔9〕。 Levina等〔10〕將 H460肺癌細胞株培養(yǎng)細胞通過阿霉素(ADM)、順鉑(CDDP)、依托泊苷(VP-16)化療后得到的細胞能形成新的克隆,且表達CD133、干細胞因子受體(CD117,又叫 C-KIT)、胚胎干細胞相關蛋白等干細胞標志物,分化后祖細胞失去 CD133表達,重新表達細胞角蛋白 8/18(CK 8/18)和獲得化療藥物敏感性。作者認為這些細胞就是肺癌干細胞,化療能導致肺癌干細胞的增殖和抑制其分化,這與其大量的細胞因子網產物有關。董強剛等〔11〕研究卻發(fā)現(xiàn),在 A 549和 SPC-A 1肺腺癌細胞株中應用磁性細胞分選(MACS)CSC時發(fā)現(xiàn) CD133-、多藥耐藥蛋白(MRCP+)、CD24+、表皮生長因子受體(EGFR+)、胰島素樣生長因子受體(IGF-R1+)的細胞具備 CSC特征。Jiang等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)熒光活化細胞分選系統(tǒng)(FACS)分離出的肺癌細胞高表達醛脫氫酶 1(ALDH1)和 CD133在體外高表達 CSC特征,包括無限增殖、自我更新、分化和對化療耐藥的能力,體外實驗證明醛脫氫酶 1陽性細胞可形成腫瘤,具有與原來腫瘤相似的異質性。醛脫氫酶 1成為肺癌干細胞的標志。

巢蛋白是神經祖細胞的生物學標記。Kondo等〔13〕還發(fā)現(xiàn)體外長期培養(yǎng)的腫瘤細胞系中也存在類似的CSC,稱為邊緣細胞群(side population,SP)。因干細胞表達乳腺癌耐藥蛋白(BCRP),可排斥熒光染料羅丹明 123(Rho123)和 Hoechst33342,通過熒光染色技術結合流式細胞分選技術即熒光活化細胞分選系統(tǒng)分選腫瘤細胞,沒有熒光的那群不被染色的細胞叫邊緣細胞群。Han〔14〕研究發(fā)現(xiàn)具有 CSC特性的 MCF7和 T47D乳腺癌細胞系存在邊緣細胞群且表達乳腺癌干細胞分子標志物,其邊緣細胞群在體外形成腫瘤,且邊緣細胞群比非邊緣細胞群對放射線更易產生耐受,進一步證明了邊緣細胞群中存在 CSC。

CSC的鑒定主要有體內移植和體外培養(yǎng)兩個方面〔14〕。體內移植是將分離所得 CSC和一般腫瘤細胞分別移植到非肥胖性糖尿病/重度聯(lián)合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠體內,因 CSC僅需少量即可形成腫瘤;而一般腫瘤細胞需要大量細胞才能形成腫瘤。Bussolati〔15〕研究發(fā)現(xiàn)了 CSC存在于腎細胞癌中。間充質干細胞存在于正常大鼠腎臟中,實驗挑選 5個腎細胞癌患者,其癌細胞中均表達間充質干細胞標志 CD105,將 CD105(+)細胞群注射到重度聯(lián)合免疫缺陷小鼠體內,這些細胞群表現(xiàn)出致瘤性,克隆出具有 CD105(+)的細胞,觀察到 CD105(+)的細胞有以下干細胞特征:①具有巢蛋白,干細胞調控因子(Nanog),胚胎干細胞相關蛋白等干細胞表面分子標志;②有克隆形成能力;③有形成瘤球黏著力;④體外生長可分化為內皮和上皮細胞;⑤體外移植可形成 CD105抗原(+)具有致瘤性的細胞群和 CD105抗原(-)的非致瘤性細胞群。

體外培養(yǎng)采用無血清培養(yǎng)基,通過集落形成實驗比較兩者差異。目前有學者提出,微流控芯片技術可發(fā)現(xiàn)更多CSC生物標記,作為識別與鑒定 CSC的方法〔16〕。最近,Cho等〔17〕將用流式細胞分選出的胸腺抗原 1(Thy1+)CD24+乳腺腫瘤細胞注射到動物模型中,發(fā)現(xiàn)占 1%～4%的Thy1+CD24+相比 Thy1-CD24-細胞含有更多具有致瘤性的成腫瘤細胞,且傳代的腫瘤與原發(fā)腫瘤在表型和生物學特性上具有很多相似性。生物芯片技術發(fā)現(xiàn)兩種細胞的基因表達存在差異,這為評估乳腺癌患者預后提供了新思路。但還有學者認為因對 CSC的鑒定采用了異種移植,因此對CSC學說以及其是否適用于所有類型的癌癥仍存在爭議。Kelly等〔18〕認為是人和小鼠細胞因子受體不相容導致了實驗結果的偏差,通過小鼠腫瘤細胞移植均產生淋巴瘤的實驗,認為這類細胞應被稱為“腫瘤傳播細胞”。Adams等〔19〕通過實驗認為異種移植系統(tǒng)低估了能維持人類腫瘤生長的細胞比例。Yun等〔20〕還提出轉基因小鼠模型可用來檢測小鼠對人 CSC的宿主反應。

4 CSC與消化道腫瘤的關系

目前,消化系統(tǒng)腫瘤發(fā)病率較高,治愈率低,因此消化道腫瘤中是否存在 CSC引起了大家的關注。Haraguchi等〔21〕在 16種消化系統(tǒng)腫瘤細胞系中分離到了邊緣細胞群,分布占細胞總數(shù)的 0.3%～2.2%,在肝癌細胞系 Huh7與結腸癌細胞系8W480中,邊緣細胞群表現(xiàn)出自我更新以及分化能力,能夠產生邊緣細胞群和非邊緣細胞群。說明消化系統(tǒng)的一些腫瘤中含有擁有干細胞特征的邊緣細胞亞群。

4.1 CSC與口腔癌 Zhang等〔22〕分離口腔鱗狀細胞癌(OCC)中邊緣細胞群和非邊緣細胞群并比較二者差異,邊緣細胞群在裸鼠中有更強的集落形成能力,形成腫瘤需要 10 000個邊緣細胞群細胞,而需要 1 000 000個非邊緣細胞群細胞,邊緣細胞群細胞高表達多藥耐藥蛋白(ABCG2)、ABCB1、CD44、胚胎干細胞相關蛋白(oct-4),致癌基因(Bmi-1),神經系統(tǒng)多梳蛋白(NSPc1)和細胞角蛋白19,并且邊緣細胞群細胞可分化形成邊緣細胞群和非邊緣細胞群,而非邊緣細胞群只能分化成非邊緣細胞群?？谇击[狀細胞癌的邊緣細胞群細胞具有 CSC表型且對口腔癌的發(fā)生起重要作用。

4.2 CSC與胃癌 Takaishi等研究通過克隆形成實驗和小鼠體內成瘤實驗證明胃 Ca中有 CSC,且成瘤試驗與胃Ca細胞的一種表面分子標記物一致,而利用這種分子篩選的陽性細胞具有良好的克隆形態(tài)能力與體內成瘤能力,這些陽性細胞大概占腫瘤細胞的 1%～10%,Takaishi等的研究結果有力地支持了存在胃 Ca干細胞的觀點〔23〕,Fukuda等也在胃 Ca細胞系中分離到一些具有腫瘤形成能力的細胞〔24〕。

4.3 CSC與結腸癌 但對CD133是否可作為結腸癌干細胞表面分子標志物的回答出現(xiàn)了分歧,Dalerba等〔25〕發(fā)現(xiàn)動物模型嗜同種的鈣非依賴性上皮細胞黏附分子(EpCAM)high/CD44+的腫瘤細胞具有腫瘤干細胞特性,還高表達乙醛脫氫酶 1,且表達 CD133+的細胞群要大于 CD44+細胞群,進一步研究發(fā)現(xiàn),間充質干細胞標記物 CD166抗原分子可作為結直腸癌干細胞獨立的標記物;因此,他們認為 EpCAMhigh/CD44+/CD166+比CD133+能更好地作為結直腸癌干細胞的標記物。

Du等〔26〕認為 CD44比 CD133更適合作為結直腸干細胞的分子標記物。但后來 Shmelkov等〔27〕通過建立半乳糖苷酶基因(LacZ)敲入小鼠模型(CD133lacZ/+),即半乳糖苷酶基因的表達是由內源的 CD133啟動子驅動的;發(fā)現(xiàn) CD133既表達于干細胞,也表達于分化的結腸上皮細胞中,但在轉移結腸癌和具有致瘤性的細胞中并不都表達 CD133,且研究發(fā)現(xiàn)表達CD133+和CD133-的轉移腫瘤細胞均具有致瘤性,而且具有轉移性的CD133-的腫瘤細胞可以形成侵襲性更強的腫瘤,并表達典型成腫瘤細胞的表型標記物 CD44(CD44+CD24-),而表達CD133-的細胞中為 CD44-CD24+。因此,CD133+是否能作為鑒定結腸癌干細胞的標記還需要進一步的研究證實。

4.4 CSC與肝癌 原發(fā)性肝癌不同病理組織類型均可表達細胞角蛋白 7(CK7)、細胞角蛋白 19、甲胎蛋白、干細胞因子受體和胸腺抗原 1等多種肝干細胞標志,暗示了肝癌干細胞可能起源于肝干細胞。Chiba等〔28〕利用肝細胞癌(HCC)細胞系研究邊緣細胞群在非肥胖性糖尿病/重度聯(lián)合免疫缺陷小鼠致瘤的作用和 CSC的作用,實驗結果表明邊緣細胞群具有強致瘤性、更高增殖潛能和抗細胞凋亡的特性,細胞免疫化學檢查顯示邊緣細胞群保持了大量的肝細胞和膽管細胞系的特征,進一步證實了肝癌中 CSC的存在。Yamashita〔29〕發(fā)現(xiàn) 235個肝癌標本可分離出嗜同種的鈣非依賴性上皮細胞黏附分子(Ep CAM+)甲胎蛋白 AFP(+)和EpCAM(-)AFP(-)兩種細胞,通過對基因表達和信號轉導通路分析得出EpCAM(+)AFP(+)的肝癌細胞亞型具有肝癌干細胞或前體細胞的特征,EpCAM(+)肝癌細胞具有干細胞的自我更新和分化能力,可使非肥胖性糖尿病/重度聯(lián)合免疫缺陷小鼠形成高侵襲性肝細胞癌。因此肝細胞癌的生長和侵襲是由一組嗜同種的鈣非依賴性上皮細胞黏附分子(+)細胞決定的,進一步用小干擾 RNA(SiRNA)干擾Wnt/beta-catenin通路信號肽可減弱 EpCAM(+)肝癌細胞活性〔30〕。實驗表明〔31〕Wnt信號通路異常激活賦予了肝干細胞的高增殖潛能和抗細胞凋亡的特性,嗜同種的鈣非依賴性上皮細胞黏附分子可成為肝癌的分子治療靶點。

4.5 CSC與胰腺癌 胰腺診斷明確時多處于進展期,對常規(guī)化療和放療都不敏感,5年存活率只有 3%。Heidt等〔32〕用人胰腺癌組織制成的細胞懸液中,候選干細胞標志 CD44、CD24和上皮細胞膜抗原(ESA)的表達率為 3%～8%,在傳代細胞中亦保持較為恒定的比例。以 CD44、CD24和上皮細胞膜抗原為表型分選細胞分別在 6/9和 3/11只小鼠中成瘤,而未分選的細胞需相應分選細胞數(shù)量的 100倍才有腫瘤生長。因此認為,CD44、CD24和上皮細胞膜抗原是胰腺腺癌干細胞的標志〔32〕。研究表明〔32〕,僅占胰腺癌細胞 0.2%～0.8%的 CD44+CD24+ESA+細胞的致瘤能力是其他腫瘤細胞的 100倍,注射 100個細胞后約 50%的動物形成組織學上不可分辨的相同腫瘤,表現(xiàn)出高度自我更新和分化等干細胞的特性,同時其 SonicHedgehog基因(SHH)的表達有所升高,說明 SHH信號通路對于自我更新同樣具有調節(jié)作用〔32〕。通過以上 Wnt信號通路和 SHH信號通路在肝癌和胰腺癌等不同組織的干細胞的自我更新的調節(jié)作用,使得信號通路與自我更新關系的研究更加有趣。

5 實體CSC的研究意義和未來研究方向

5.1 研究意義 干細胞表達多藥耐藥蛋白(MDR1)及ABC轉運蛋白,對化療不敏感,若 CSC高表達這類分子,也有可能對治療耐受,這解釋了腫瘤治療后復發(fā)轉移現(xiàn)象。傳統(tǒng)腫瘤治療都是針對所有的腫瘤細胞,且認為腫瘤細胞具有功能同質性,而實際上如果腫瘤源于 CSC,先前諸多關于腫瘤發(fā)生發(fā)展機制,細胞信號途徑的等的研究成果需要重新評價,因為CSC的生物學行為與其他腫瘤細胞可能有質的差別,如果能有效選擇性殺傷 CSC,挖掘出針對 CSC而不損傷正常干細胞的治療新靶點,就會為臨床徹底治愈腫瘤帶來新希望。

5.2 未來的研究方向 首先是對正常組織干細胞生物學行為、細胞表面標志物的研究,為更多實體CSC的分離鑒定提供理論支持。第二,研究實體CSC與正常組織干細胞及其他異質腫瘤細胞的差異基因及信號轉導途經的差異進行功能研究,可以闡明 CSC的起源以及腫瘤發(fā)生發(fā)展的基本機制,為治療實體腫瘤提供新靶點。因 CSC的含量極少且不斷分化,所以發(fā)展高效的體外培養(yǎng)系統(tǒng)、細胞擴增技術及維持干細胞未分化狀態(tài)技術是今后研究的艱巨任務。

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