孫 偉 徐曉斌 姚學(xué)玲 馬亞紅 徐傳驤

(1西安建筑科技大學(xué)機(jī)電工程學(xué)院 西安 710055)

(2西安交通大學(xué)電力設(shè)備與電氣絕緣國家重點實驗室 西安 710049)

(3江蘇大學(xué)電氣信息工程學(xué)院 鎮(zhèn)江 212013)

1 引 言

生物材料低溫保存研究表明，在低溫冷凍過程中，細(xì)胞內(nèi)、外冰晶的形成以及由此產(chǎn)生的離子偏析是導(dǎo)致細(xì)胞死亡的主要原因［1－3］。在低溫狀態(tài)下，水分子結(jié)晶致使生物體中的結(jié)合水從組織結(jié)構(gòu)中被撕裂出來，從而破壞了細(xì)胞的組織結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。1937 年，BJ.Luyet提出了玻璃化低溫保存方法［4］，即采用非?？焖俚慕禍胤椒?，使水分子以玻璃態(tài)固化，從而避免水分子結(jié)晶造成的細(xì)胞死亡。然而，由于生物材料本身存在著較大的熱容和較低的熱導(dǎo)，實現(xiàn)玻璃化保存存在很大的困難，甚至無法實現(xiàn)［5－6］。1949年，英國生物學(xué)家發(fā)現(xiàn)了低溫保護(hù)劑在生物材料低溫保存中的作用［7］，使得玻璃化低溫保存方法得到了快速發(fā)展。

根據(jù)降溫速率的差異，冰晶形成導(dǎo)致細(xì)胞損傷存在著不同的低溫?fù)p傷機(jī)理，對此，P Mazur［8］根據(jù)實驗結(jié)果提出了“兩因素假說”，即慢速降溫速率引起的“溶質(zhì)損傷”和快速降溫速率引起的“胞內(nèi)冰損傷”。跟據(jù)“兩因素假說”提出的細(xì)胞低溫?fù)p傷機(jī)理，出現(xiàn)了“兩步法”低溫保存方法，即在不同階段采用不同的降溫速率，從而可以有效避免慢速冷凍引起的“溶質(zhì)損傷”和快速冷凍引起的“胞內(nèi)冰損傷”。

在生物材料低溫保存研究中，兩種方法都取得了較好的效果，但也存在一些問題。玻璃化方法對微小生物體低溫保存效果明顯，但是由于這種方法需要極快的降溫速率(＞106℃/min)，無法實現(xiàn)體積相對較大的生物材料的低溫保存。兩步法在一定程度上克服了玻璃化方法的缺點，但其操作程序復(fù)雜，而且由于存在著生物多樣性的問題，不同生物材料所需的降溫過程相差很大，這為實際應(yīng)用帶來了很大困難。另外，兩種方法都需要使用高濃度的低溫保護(hù)劑，而低溫保護(hù)劑對細(xì)胞具有毒性［9］，濃度越高，毒性越大，過量使用會對細(xì)胞產(chǎn)生傷害。

冰晶形成是水分子在低溫狀態(tài)下重定向結(jié)晶的過程，而水分子是一種強(qiáng)極性分子，電場作用會對水分子的重定向產(chǎn)生影響。分子動力學(xué)研究結(jié)果顯示，電場作用能夠引起水分子排列結(jié)構(gòu)變化，表明電場影響了水的相變過程［10］;一些實驗研究結(jié)果也表明，電場對冰晶形成有顯著影響［11－16］。微波在低溫保存中的應(yīng)用研究結(jié)果顯示，在冰晶形成過程中微波具有抑制冰晶生長的作用［17－18］。電場對水相變過程的影響，為生物材料低溫保存技術(shù)的發(fā)展提供了新的思路。A.Petersen［19］等設(shè)計了一套實驗裝置，通過脈沖電場誘發(fā)過冷溶液中冰核形成，從而達(dá)到控制溶液中冰晶的形成溫度，這種方法在兩步法低溫保存技術(shù)中有重要的應(yīng)用價值。

本文以生理鹽水為實驗樣品，采用介電方法［20－21］研究交變電場對生理鹽水凍結(jié)后形成的冰體微觀結(jié)構(gòu)的影響，探尋能有效控制冰晶形成的新方法。

2 實驗方法和結(jié)果

實驗樣品為生理鹽水，降溫速率為20℃/min，在降溫過程中施加不同頻率的交變電場，干擾溶液在低溫下的相變過程，待溶液充分凍結(jié)后，測量溶液凍結(jié)后的相對介電常數(shù)。

實驗腔體如圖1所示，電極直徑為20 mm，電極之間距離為1 mm;冷凍過程中，施加在上下電極上的正弦波電壓Vp－p=1 V，假設(shè)電極之間產(chǎn)生的電場為均勻電場，則電極之間電場強(qiáng)度最大值為Emax=5×102V/m。測量系統(tǒng)采用Concept 80寬帶介電特性測試系統(tǒng)，該系統(tǒng)測量范圍寬、測量數(shù)據(jù)精確，能夠為實驗提供準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。

圖1 實驗腔體Fig.1 Experimental container

圖2 顯示生理鹽水凍結(jié)后的相對介電常數(shù)隨頻率的變化關(guān)系，其中，“”表示的數(shù)據(jù)為沒有電場作用的實驗結(jié)果，其它為不同頻率電場干擾下的實驗結(jié)果。在冷凍過程中施加交變電場作用是為了干擾其相變過程，施加的干擾電場頻率分別為:50 Hz、1 kHz、10 kHz、50 kHz、500 kHz、5 MHz、20 MHz。相對介電常數(shù)測量頻率范圍為:50—1×107Hz，測量溫度為－60℃。

圖2 相對介電常數(shù)隨頻率的變化關(guān)系，測量溫度－60℃;測量頻率范圍50－1×107HzFig.2 Relationship between permittivity and frequency，measuring temperature－60℃，measuring frequency range 50－1×107Hz

實驗數(shù)據(jù)顯示，交變電場對生理鹽水凍結(jié)后的相對介電常數(shù)有顯著的影響，與沒有電場作用情況相比較，在交變電場作用下，生理鹽水凍結(jié)后在低頻段的相對介電常數(shù)明顯增加，其中500 kHz交變電場作用對相對介電常數(shù)的影響效果最為顯著。測量頻率為50 Hz時，生理鹽水在500 kHz交變電場作用下凍結(jié)后的相對介電常數(shù)為1 340.4;沒有電場作用情況下生理鹽水凍結(jié)后的相對介電常數(shù)為552.39，前者比后者高出一倍多。

生理鹽水凍結(jié)后的相對介電常數(shù)來自于以下幾種極化形式的貢獻(xiàn):(1)水分子轉(zhuǎn)向極化;(2)熱離子極化或雙層介質(zhì)極化;(3)電子位移極化。當(dāng)測量頻率在低頻范圍時，上述幾種極化形式同時存在，介質(zhì)表現(xiàn)出很高的介電常數(shù);當(dāng)測量頻率在高頻范圍時，上述1、2兩種極化形式來不及建立，介電常數(shù)主要由電子位移極化所貢獻(xiàn)，此時介質(zhì)表現(xiàn)出的介電常數(shù)很小。如圖2所示，在測量頻率為100 kHz情況下，相對介電常數(shù)僅在3—4之間。

實驗結(jié)果顯示，交變電場作用對生理鹽水凍結(jié)后的相對介電常數(shù)影響顯著，特別是在低頻段，影響最為明顯。從介電物理的角度分析，介電常數(shù)的變化必然伴隨著物質(zhì)內(nèi)部微觀結(jié)構(gòu)的改變，也就是說，在交變電場作用下，生理鹽水凍結(jié)后形成的冰體組成結(jié)構(gòu)可能發(fā)生了改變。因此，可以通過介電常數(shù)的變化對冰體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

3 分析與討論

根據(jù)含鹽水溶液的凍結(jié)特性，溶液在降溫過程中首先是在某些區(qū)域內(nèi)形成冰核，而后冰核逐漸長大形成冰晶。在溶液完成從液相轉(zhuǎn)變?yōu)楣滔嗟倪^程中，溶液中水分子和離子成分的凍結(jié)過程存在有以下兩種情況。

第1種情況:在冰晶的生長過程中，離子被偏析出冰晶體之外，冰晶體中不含有離子成分，隨著冰晶不斷長大，形成不含離子成分的大體積純水冰晶。

第2種情況:在溶液的凍結(jié)過程中，首先是冰核形成，然后進(jìn)入冰晶生長過程，在冰晶還沒有形成宏觀意義上的大體積純水冰晶之前，離子被凍結(jié)在冰晶體之間，由于離子的存在，冰晶無法繼續(xù)生長成為大體積的純水冰晶，從而形成體積微小的“微晶冰”。受到離子產(chǎn)生的強(qiáng)電場作用，靠近離子周圍的水分子結(jié)構(gòu)不再是具有正四面體結(jié)構(gòu)的冰晶(晶態(tài))，由于離子產(chǎn)生的強(qiáng)電場所引起的水分子強(qiáng)烈的定向作用，破壞了冰晶所具有的正四面體結(jié)構(gòu)，從而在靠近離子周圍區(qū)域里形成了非晶態(tài)的冰體結(jié)構(gòu)。在這種情況下，純水冰被包含在鹽離子之間，而存在于鹽離子之間的純水冰有兩種結(jié)構(gòu)形式:晶態(tài)冰(微晶冰)和非晶態(tài)冰。這種結(jié)構(gòu)的冰體中含有3種成分:鹽離子、微晶冰和非晶態(tài)冰，本文稱之為“含鹽冰”。

根據(jù)上述分析，含鹽水溶液凍結(jié)后形成的冰體結(jié)構(gòu)中存在有兩種形態(tài)的冰體結(jié)構(gòu):純水冰晶和含鹽冰。兩種冰體結(jié)構(gòu)交疊在一起，構(gòu)成“復(fù)合冰”結(jié)構(gòu)。從介電物理的角度，將“復(fù)合冰”結(jié)構(gòu)模型看作復(fù)合介質(zhì)來處理，其相對介電常數(shù)可以由下式表示:

式中:ε1為第1種成分的相對介電常數(shù);ε2為第2種成分的相對介電常數(shù);x為第1種成分的體積分?jǐn)?shù)。k的取值由兩種介質(zhì)成分的體積分布所決定，當(dāng)兩種成分排列成垂直于電場的連續(xù)層時，取k=–1;當(dāng)兩種成分排列成平行于電場的連續(xù)層時，取k=1;當(dāng)兩種成分既不呈并聯(lián)、又不呈串聯(lián)排列，而是趨于均勻分布時，k趨近于零。

對于k趨近于零的情況，式(1)可以變換成如下形式:

式(2)通常適用于均勻分布的復(fù)合介質(zhì)，本文將式(2)用來近似描述含鹽水溶液凍結(jié)后形成的復(fù)合冰結(jié)構(gòu)模型。

對于由純水冰晶和含鹽冰組成的復(fù)合介質(zhì)，根據(jù)式(2)，設(shè)ε1為含鹽冰的相對介電常數(shù)，ε2為純水冰晶的相對介電常數(shù)，那么x即表示含鹽冰在復(fù)合冰介質(zhì)中所占有的份額。由式(2)可得:

根據(jù)實驗結(jié)果，結(jié)合式(4)，可以對交變電場對復(fù)合冰結(jié)構(gòu)中純水冰晶和含鹽冰所占份額的影響進(jìn)行分析。

式(3)中有3個參數(shù)，ε為復(fù)合冰的相對介電常數(shù)，即為實驗測量值;ε2為純水冰晶的相對介電常數(shù)，是已知量;ε1為含鹽冰的相對介電常數(shù)，未知量。為了簡化分析，采用對比的方法討論交變電場對純水冰晶和含鹽冰所占份額的影響。討論分兩種情況:一是在溶液冷凍過程中沒有電場作用;二是在溶液冷凍過程中施加交變電場作用。

設(shè)定xN為沒有電場作用情況下，溶液凍結(jié)后含鹽冰在復(fù)合冰中所占份額;εN為沒有電場作用情況下，復(fù)合冰相對介電常數(shù);xY為交變電場作用情況下，溶液凍結(jié)后含鹽冰在復(fù)合冰中所占份額;εY為交變電場作用情況下，復(fù)合冰相對介電常數(shù)。

在復(fù)合冰體積總量保持恒定不變的情況下，含鹽冰體積份額x數(shù)值的增加，就意味著純水冰晶體積份額的減少;反過來，含鹽冰體積份額x數(shù)值的減少，就意味著純水冰晶體積份額的增加。

定義:

即:ξ表示一種比例關(guān)系，反映了沒有電場作用與施加電場作用兩種情況下含鹽冰在復(fù)合冰中所占份額的變化情況。

由式(3)和式(4)，得:

表1給出了在測量頻率為50 Hz、測量溫度為－60℃時生理鹽水在不同冷凍條件下凍結(jié)后形成的復(fù)合冰的相對介電常數(shù)值。

表1 生理鹽水在不同冷凍條件下凍結(jié)后的相對介電常數(shù)，測量頻率50 Hz、測量溫度－60℃Table 1 Permittivity of normal saline frozen under different condition，measuring frequency 50 Hz，measuring temperature －60℃

式(5)中，ε2為純水冰晶的相對介電常數(shù)，在測量頻率為50 Hz，測量溫度為－60℃的條件下，實際測量純水冰晶的相對介電常數(shù)為56。由式(5)和表1，可以得出不同情況下的ξ值，結(jié)果如表2所示。

表2 生理鹽水在不同冷凍條件下凍結(jié)后的ξ值Table 2 ξ values under different condition

根據(jù)ξ的定義，表2顯示出，生理鹽水在不同冷凍條件下凍結(jié)后，含鹽冰在復(fù)合冰中所占份額出現(xiàn)顯著變化。同沒有電場作用情況相比較，交變電場作用使含鹽冰所占份額明顯增加，頻率為500 kHz的交變電場作用效果最為顯著。根據(jù)計算結(jié)果，頻率為500 kHz的交變電場作用情況下，ξ=1.70;也就是說，頻率為500 kHz的交變電場作用情況下含鹽冰所占份額比無電場作用情況下含鹽冰所占份額增加了近70%。

在復(fù)合冰體積總量保持恒定不變的情況下，交變電場作用使復(fù)合冰中含鹽冰所占份額增加，也就預(yù)示著復(fù)合冰中純水冰所占份額減少，這就反映出交變電場可以有效地抑制生理鹽水凍結(jié)過程中純水冰晶的生長。從低溫生物保存的損傷機(jī)理分析，純水冰晶所占份額的減少與含鹽冰所占份額的增加對生物材料的低溫保存是非常有益的。

4 結(jié) 論

采用介電方法研究交變電場對生理鹽水凍結(jié)后形成的冰體結(jié)構(gòu)的影響。研究發(fā)現(xiàn)，在交變電場作用下，冰的相對介電常數(shù)明顯升高，其中500 kHz交變電場作用效果最為顯著。根據(jù)含鹽水溶液凍結(jié)特性分析，提出由純水冰晶和含鹽冰構(gòu)成的復(fù)合冰結(jié)構(gòu)模型，采用均勻混合復(fù)合介質(zhì)介電模型，分析計算了交變電場對復(fù)合冰結(jié)構(gòu)中含鹽冰所占份額的影響。結(jié)果顯示，在500 kHz交變電場作用下，含鹽冰在復(fù)合冰結(jié)構(gòu)中所占份額比無電場作用增加了70%。

1 Karow A M，Webb W R.Tissue freezing［J］.Cryobiology，1965，2(3):99-108.

2 Mazur P.The role of intraceallular freezing in the death of cells cooled at supraoptimal rates［J］.Cryobiology，1977，14(3):251-272.

3 Pegg D E，Diaper M P.The mechanism of injury to slowly-frozen erythrocytes［J］.Biophysical Journal，1988，54(3):471-488.

4 Luyet B J.The vitrification of organic collids and of protoplasm［J］.Biodynamica，1937，1:1-14.

5 Luyet B J，Tanner J，Rapatz G.X-ray diffraction study of the structure of rapidly frozen gelatin solutions［J］.Biodynamica，1962，9:21-46.

6 Luyet B J.On the amount of water remaining amorphous in frozen aqueous solutions［J］.Biodynamica，1969，10:277-291.

7 Polge C，Smith A U，Parkes A S.Revival of spermatozoa after vitrification and dehydration at low temperature［J］.Nature，1949，164:666-676.

8 Mazur P，Leibo S P，Chu E H Y.Two factor hypothesis of freezing injury-evidence from Chinese hamster tissue culture cells［J］.Experimental Cell Research，1972，71(2):345-355.

9 Mukaida T，Wada S，Takahashi K，et al.Vitrification of human embryos based on the assessment of suitable conditions for 8-cell mouse embryos［J］.Human Reproduction，1998，13(10):2874-2879.

10 Jung D H，Yang J H，Jhon M S.The effect of an external electric field on the structure of liquid water using molecular dynamics simulations［J］.Chemical Physics，1999，244:331-337.

11 Braslavsky I，Lipson S G.Electrofreezing effect and nucleation of ice crystals in free growth experiments［J］.Applied Physics Letters，1998，72(2):264-266.

12 Hozumi Tsutomu，Saito Akio，Okawa Seiji，et al.Effects of electrode materials on freezing of supercooled water in electric freeze control［J］.International Journal of Refrigeration，2003，26(5):537-542.

13 Hozumi Tsutomu，Saito Akio，Okawa Seiji，et al.Effects of shapes of electrodes on freezing of supercooled water in electric freeze control［J］.International Journal of Refrigeration，2005，28(3):389-395.

14 Sun Wei，Xu Xiaobin，Zhang Hong，et al.Effects of dipole polarization of water molecules on ice formation under an electrostatic field［J］.Cryobiology，2008，56(1):93-99.

15 Sun Wei，Xu Xiaobin，Zhang Hong，et al.The mechanism analysis of NaCl solution Ice formation suppressed by electric field［C］.ICPADM 2005:Proceedings of the 8th International Conference on Properties and Applications of Dielectric Materials，2006，1-2:770-773.

16 Sun Wei，Xu Xiaobin.Effect of alternated electric field on the Ice formation during freezing process of 0.9%K2MnO4Water［C］.ICPADM 2006:Proceedings of the 8th International Conference on Properties and Applications of Dielectric Materials，2006，1-2:774-777.

17 Jackson T H，Ungan A，Critser J K，et al.Novel microwave technology for cryopreservation of biomaterials by suppression of apparent ice formation［J］.Cryobiology，1997，34(4):363-372.

18 Hanyu，Y.，Ichikawa M.，Matsumoto G.An improved cryofixation method:cryoquenching of small tissue blocks during microwave irradiation［J］.Journal of Microscopy-Oxford，1992，165(2):255-271.

19 Petersen A.Schneider H，Rau G，et al.A new approach for freezing of aqueous solutions under active control of the nucleation temperature［J］.Cryobiology，2006，53(2):248-257.

20 Hippel A V.The dielectric relaxation spectra of water，ice，and apueous solutions，and their interpretation.IEEE Transactions on Electrical Insulation，1988，23(5):801-840.

21 劉瑛巖，鐘力生，徐傳驤.生物材料低溫介電損耗機(jī)理的研究［J］.生物物理學(xué)報，1998，14(3):516-520.