張 捷，崔文玉，汪 海，2，3

(1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，北京 100850;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所，天津 300050;3.賽德維康醫(yī)藥研究院，北京 100039)

膽堿酯酶抑制劑，即有機(jī)磷毒物不僅被用于戰(zhàn)爭(zhēng)和恐怖事件，還產(chǎn)生重大的職業(yè)危害。膽堿酯酶活性被抑制導(dǎo)致體內(nèi)乙酰膽堿過(guò)度蓄積，持續(xù)作用于乙酰膽堿受體(分M和N受體兩大類)，誘發(fā)膽堿能危象［1］。然而，傳統(tǒng)觀點(diǎn)一直認(rèn)為［2］N 受體在受到持續(xù)刺激的狀態(tài)下處于一種無(wú)功能的失敏狀態(tài)，相關(guān)研究局限在M受體上。因此，臨床上僅僅靶向M受體的阿托品為核心的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)救治措施仍存在諸多局限［3］。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究［4］發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元N受體失敏后并非處于無(wú)功能狀態(tài)，而是通過(guò)降低M受體對(duì)其拮抗劑的親和力，增高M(jìn)受體對(duì)其激動(dòng)劑的親和力，從而極大地削弱了靶向M受體的抗毒療效。本實(shí)驗(yàn)室基于上述理論，發(fā)現(xiàn)了兼具抗中樞和外周M和N受體作用的小分子化合物賓賽克嗪，其抗毒效應(yīng)優(yōu)于單純靶向M或N受體的藥物及其聯(lián)合配伍的藥物［5］。

由于在中毒過(guò)程中N受體長(zhǎng)期處于失敏狀態(tài)，中毒癥狀主要表現(xiàn)為M樣毒性反應(yīng)。然而，在N受體失敏狀態(tài)下，拮抗劑對(duì)M受體功能的拮抗作用強(qiáng)度很難精確判斷。本研究首次在膽堿能突觸模型(大鼠頸上交感神經(jīng)元)上應(yīng)用電生理技術(shù)研究神經(jīng)元N受體失敏對(duì)賓賽克嗪和阿托品拮抗M受體功能作用的影響。

1 材料與方法

1.1 主要藥品與試劑賓賽克嗪由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所合成;DMEM(dulbecco's modified eagle medium，高糖)、馬血清、ITS(胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、亞硒酸鈉三合一)為Gibco產(chǎn)品;胰蛋白酶、河豚毒素(TTX)、煙堿、氧化震顫素、阿托品、K2ATP、HEPES均為Sigma產(chǎn)品;其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

1.2.1 交感神經(jīng)元培養(yǎng)液 馬血清10%，ITS 1%，DMEM 88%，谷氨酰胺1%，青霉素0.8×104U+鏈霉素1×104U/100 ml飼養(yǎng)液。

1.2.2 頸上交感神經(jīng)元的培養(yǎng) 取出生1～2 d的Wistar大鼠，放入體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇中浸泡消毒，在解剖顯微鏡下取仰臥位固定，沿頸正中線切開(kāi)皮膚暴露頸總動(dòng)脈，在雙側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈分支處分離出頸上交感神經(jīng)節(jié)，放入0℃ ～4℃的磷酸鹽緩沖液中沖洗，剝離附著的結(jié)締組織及被膜后將其分成數(shù)小塊，放入0.25%胰蛋白酶消化液中，于37℃、5%CO2孵箱中消化30 min，以500 r·min－1離心2 min，棄去上清，以含有10%馬血清的培養(yǎng)基終止消化并離心清洗兩次，用2～3 mm口徑的吸管輕輕吹打分散細(xì)胞，將分散好的細(xì)胞懸液加入預(yù)先涂有多聚賴氨酸的35 mm培養(yǎng)皿中，于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)6～9 d用于膜片鉗實(shí)驗(yàn)。

1.3 全細(xì)胞電流記錄

1.3.1 溶液配制 電極內(nèi)液(mmol·L－1):140 KCl，2 MgCl2，10 HEPES，10 EGTA，5 K2ATP，用KOH調(diào)節(jié)pH=7.3。記錄IM的細(xì)胞外液(mmol·L－1):160 NaCl，2.5 KCl，5 CaCl2，1 MgCl2，10 HEPES，8 D-Glucose，0.5 TTX。用 NaOH 調(diào)節(jié) pH=7.4。

1.3.2 膜片鉗記錄系統(tǒng) 包括膜片鉗放大器(Axonpatch 200B)、模/數(shù)轉(zhuǎn)換器(Digidata 1322A)、軟件平臺(tái)(pClamp 8.2)、倒置相差顯微鏡(Olympus IX50)、三維微操縱儀(Narishige MO2103)。記錄電極由硬質(zhì)有芯玻璃管經(jīng)電極拉制儀(Narishige PP-830)兩步拉制而成，經(jīng)拋光儀(MF2830)拋光后電極電阻約為3～5 MΩ。實(shí)驗(yàn)前用細(xì)胞外液替換培養(yǎng)液，電極與細(xì)胞形成千兆歐姆封接后，用ZAP(500 μs)破膜，形成全細(xì)胞記錄模式，細(xì)胞膜電位鉗制在－70 mV，全細(xì)胞接入電阻低于20 MΩ的細(xì)胞適合后續(xù)記錄，補(bǔ)償膜電容，串聯(lián)電阻補(bǔ)償80%。采樣軟件為 Clampex 8.2，低通濾波2 kHz，采樣頻率5 kHz。

1.3.3 M電流(IM)的記錄 細(xì)胞膜電位首先被鉗制在－20 mV以激活M通道，然后階躍至－70 mV，時(shí)程為100 ms以關(guān)閉M通道［6］。

1.4 給藥方法

1.4.1 給藥系統(tǒng) 給藥裝置由微量壓力注射儀(PicosperitzerⅡ)、微操縱儀(Narishige NMN-21)和給藥電極組成。給藥電極由硬質(zhì)有芯玻璃管經(jīng)電極拉制儀(Narishige PP-283)拉制而成。給藥時(shí)將藥物充灌于多管給藥微玻管(口徑約為5～8 μm)內(nèi)，微玻管與壓力注射儀相連，通過(guò)微操縱儀將給藥電極移至距離記錄細(xì)胞1～2個(gè)胞體位置，調(diào)節(jié)給藥壓力使噴出的藥液覆蓋整個(gè)細(xì)胞。誘發(fā)電流經(jīng)膜片鉗放大器放大，經(jīng)數(shù)模轉(zhuǎn)換器輸入微機(jī)進(jìn)行儲(chǔ)存。

1.4.2 考察正常狀態(tài)下拮抗劑對(duì)M受體功能的拮抗作用 全細(xì)胞記錄模式形成后記錄IM作為對(duì)照。給予氧化震顫素(1 mmol·L－1，3 s)，記錄 IM。3min后給予氧化震顫素(1 mmol·L－1)與賓賽克嗪或阿托品(濃度分別為0.01 ～100 μmol·L－1)混合液3 s，記錄 IM。

1.4.3 考察N受體失敏狀態(tài)下拮抗劑對(duì)M受體功能的拮抗作用 記錄IM作為對(duì)照。給予煙堿(80 μmol·L－1，30 s)誘發(fā)N受體失敏。給予氧化震顫素(1 mmol·L－1，3 s)，記錄 IM。給予氧化震顫素(1 mmol·L－1)與賓賽克嗪或阿托品(濃度分別為0.1～1 000 μmol·L－1)混合液 3 s，記錄 IM。

1.4.4 考察N受體的失敏程度對(duì)拮抗劑拮抗M受體功能作用的影響 記錄IM作為對(duì)照。給予煙堿(80 μmol·L－1，30 s)誘發(fā) N 受體失敏。給予氧化震顫素(1 mmol·L－1，3 s)，記錄IM。在N 受體失敏后的0.5、1、2、4 min分別給予氧化震顫素(1 mmol·L－1)與賓賽克嗪或阿托品(10 μmol·L－1)混合液 3 s，記錄 IM。

1.5 數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理Clampex 8.2軟件記錄下的原始數(shù)據(jù)文件經(jīng)Clampfit 8.2軟件進(jìn)行測(cè)量分析，再將文件轉(zhuǎn)換后輸入Origin 7.5進(jìn)行作圖和必要的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。所有數(shù)據(jù)均用±s表示，n表示細(xì)胞數(shù)。運(yùn)用SAS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，同一細(xì)胞上不同時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)比較采用自身配對(duì)t檢驗(yàn)，兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)。劑量依賴性曲線采用Origin 7.5中的Logistic方程進(jìn)行擬合。半數(shù)抑制濃度及其95%可信限(IC50±L95)，量效曲線斜率及其標(biāo)準(zhǔn)誤(b±Sb)依Bliss法計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 原代培養(yǎng)的大鼠頸上交感神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)觀察經(jīng)酶分散和吸管吹打后的交感神經(jīng)元，在倒置相差顯微鏡下呈圓形亮點(diǎn)，直徑僅數(shù)微米。大多數(shù)神經(jīng)元在2 h內(nèi)貼壁，多數(shù)為單個(gè)，圓形，少數(shù)有殘留的一個(gè)短突起。24 h后，神經(jīng)元胞體清晰明亮。起初長(zhǎng)出一個(gè)細(xì)長(zhǎng)突起，并可在突起末端見(jiàn)到扁平狀生長(zhǎng)錐。3 d后胞體逐漸增大，神經(jīng)元突起增多并相互連接，形成稀疏網(wǎng)絡(luò)。6 d后神經(jīng)元胞體明顯增大，直徑可達(dá)30～50 μm，細(xì)胞核多偏于一側(cè)，核仁明顯，其突起有的交織成網(wǎng)，有的集合成束。

2.2 正常狀態(tài)下賓賽克嗪和阿托品對(duì)M受體功能的拮抗作用氧化震顫素作為特異性的M受體激動(dòng)劑，可以模擬神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的M樣作用，抑制IM(Fig 1A)。給予氧化震顫素后IM電流幅度被明顯抑制，向細(xì)胞噴射氧化震顫素(1 mmol·L－1，3 s)后IM電流幅度衰減為給藥前的(42.7±7.2)%(Fig 1B)。給予賓賽克嗪或阿托品后氧化震顫素對(duì)IM的抑制率明顯降低，且該降低作用呈現(xiàn)濃度依賴性(Fig 1B)。IC50±L95值分別為(4.83±1.27)μmol·L－1和(1.32 ±0.45)μmol·L－1;b ±Sb值分別為－2.05±0.81和－2.67±0.59。正常狀態(tài)下，賓賽克嗪對(duì)M受體的功能的拮抗作用弱于阿托品(P＜0.05)，其IC50值是阿托品IC50值的3.67倍;b±Sb值無(wú)差異(P＞0.05)。

2.3 N受體失敏狀態(tài)下賓賽克嗪和阿托品對(duì)M受體功能的拮抗作用N受體失敏后立刻給予氧化震顫素(1 mmol·L－1，3 s)，IM電流幅度衰減為給藥前的(38.5±7.4)%(Fig 1B)。給予賓賽克嗪或阿托品后氧化震顫素對(duì)IM的抑制率降低，且該降低作用呈現(xiàn)濃度依賴性(Fig 1B)。IC50±L95值分別為(52.28 ±9.76)μmol·L－1和(43.17 ±11.43)μmol·L－1;b±Sb值分別為 －3.54±1.98和 －1.17±0.15。N受體失敏狀態(tài)下，賓賽克嗪對(duì)M受體功能的拮抗作用與阿托品相當(dāng)(P＞0.05);b±Sb值差異有顯著性(P＜0.05)。N受體失敏使賓賽克嗪和阿托品對(duì)M受體功能的拮抗作用強(qiáng)度均減弱(P＜0.01)，賓賽克嗪減弱10.82倍，阿托品減弱32.7倍。

Fig 1 Antagonism against mAChRs mediated IM-inhibition by benthiactzine and atropine before and after desensitization of nAChRs.

2.4 N受體的失敏程度對(duì)賓賽克嗪和阿托品拮抗M受體功能作用的影響N受體失敏后立刻給予氧化震顫素(1 mmol·L－1，3 s)，IM電流幅度衰減為給藥前的(37.3±6.8)%。隨著N受體失敏程度逐漸減弱，賓賽克嗪和阿托品對(duì)M受體功能的拮抗作用逐漸增強(qiáng)。同時(shí)，隨著N受體的恢復(fù)，賓賽克嗪對(duì)M受體功能的拮抗作用逐漸弱于阿托品(Fig 2)。

3 討論

Fig 2 Antagonism of muscarine-induced IM-inhibition by benthiactzine and atropine(0.5，1，2，4 min)after desensitization of nAChRs

外周交感神經(jīng)節(jié)及其膽堿能突觸在有機(jī)磷毒物中毒的發(fā)生和發(fā)展的過(guò)程中起到重要作用。大鼠頸上交感神經(jīng)節(jié)(superior cervical ganglia，SCG)是體積較大的融合神經(jīng)節(jié)，節(jié)內(nèi)90%以上的細(xì)胞為神經(jīng)元。SCG神經(jīng)元上同時(shí)表達(dá)M、N兩類膽堿能受體，是良好的研究外周交感神經(jīng)特性的實(shí)驗(yàn)對(duì)象［7－8］。

M電流(IM)是首次被發(fā)現(xiàn)的受膜電壓和神經(jīng)遞質(zhì)雙重門(mén)控的唯一在閾電位附近激活的電流，與可興奮細(xì)胞的興奮性密切相關(guān)［9］。大量研究表明［10］，M受體激動(dòng)劑作用于M受體后產(chǎn)生的對(duì)IM的抑制效應(yīng)是通過(guò)M受體的M1亞型介導(dǎo)的。氧化震顫素作為特異性的M受體激動(dòng)劑，可以模擬神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的M樣作用，抑制

本研究發(fā)現(xiàn)，與正常狀態(tài)相比，在N受體失敏后，賓賽克嗪和阿托品對(duì)M受體功能的拮抗作用強(qiáng)度均明顯減弱。同時(shí)，隨著N受體逐漸從失敏狀態(tài)恢復(fù)到正常狀態(tài)，賓賽克嗪和阿托品對(duì)M受體功能的拮抗作用也逐漸恢復(fù)。結(jié)合實(shí)驗(yàn)室前期研究，推測(cè)可能是神經(jīng)元N受體失敏后并非處于無(wú)功能狀態(tài)，而是通過(guò)降低M受體對(duì)其拮抗劑的親和力，增高M(jìn)受體對(duì)其激動(dòng)劑的親和力，從而極大地削弱了靶向 M 受體的抗毒療效［13－14］。

同時(shí)，N受體失敏對(duì)賓賽克嗪和阿托品拮抗M受體功能的影響是不同的。結(jié)果顯示，在正常狀態(tài)下，賓賽克嗪對(duì)M受體功能的拮抗作用強(qiáng)度弱于阿托品。實(shí)驗(yàn)室前期研究也發(fā)現(xiàn)，在多種中樞和外周組織以及多種M受體亞型的配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)中，賓賽克嗪與M受體的親和力均遠(yuǎn)弱于阿托品［15］。這一結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)一致。但是，在N受體失敏狀態(tài)下，賓賽克嗪對(duì)M受體功能的拮抗作用強(qiáng)度與阿托品相當(dāng)。并且隨著N受體的逐漸恢復(fù)，阿托品的拮抗作用強(qiáng)度也逐漸強(qiáng)于賓賽克嗪，即N受體失敏對(duì)阿托品的抗M強(qiáng)度的減弱幅度要大于賓賽克嗪。結(jié)合實(shí)驗(yàn)室前期研究［15］，推測(cè)其原因可能是賓賽克嗪可進(jìn)入N受體開(kāi)放的通道內(nèi)部進(jìn)而造成受體的開(kāi)放通道阻斷效應(yīng)，被賓賽克嗪阻斷的受體將不能再由激活態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槭魬B(tài)，在賓賽克嗪作用下失敏態(tài)N受體數(shù)目減少，從而降低了失敏態(tài)N受體對(duì)M受體的增敏作用。

本研究進(jìn)一步提示，在膽堿酯酶抑制劑中毒過(guò)程中，失敏態(tài)N受體易化M受體功能，使得抗毒劑的抗M效應(yīng)減弱。然而，擁有M、N受體雙靶向的抗毒劑賓賽克嗪的減弱幅度要低于單純靶向M受體的阿托品，即阿托品的強(qiáng)效抗M作用在病理狀態(tài)下得不到充分發(fā)揮，反而可能是其諸多不良反應(yīng)的誘因。而賓賽克嗪的抗N作用在其速效強(qiáng)效的抗毒效應(yīng)中可能發(fā)揮重要作用。這一系列研究為發(fā)現(xiàn)新型抗毒劑提供了新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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