朱邦勇，李偉

廣西皮膚病防治研究所，南寧 530003

人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是一種可侵犯人類(lèi)上皮細(xì)胞，引起皮膚和黏膜組織良性及惡性病變(如宮頸癌)的病毒[1,2]，而且生殖道感染HPV的孕婦在分娩過(guò)程中可導(dǎo)致新生兒感染[3]。HPV有100多個(gè)型別，不同型別的生物學(xué)行為及致病能力各不相同。高危型[4](與宮頸癌和宮頸上皮內(nèi)瘤病變有關(guān))包括HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68，共13種亞型；低危型(與外生殖器尖銳濕疣等良性病變有關(guān))包括HPV 6、11、42、43、44，共5種亞型。HPV基因分型對(duì)HPV疫苗的研究、分子流行病學(xué)控制措施的制定、HPV感染的治療及預(yù)后判斷具有重要作用。HPV是一種雙鏈環(huán)狀DNA病毒。8個(gè)高度重疊的開(kāi)放讀碼框架(open reading frame，ORF)由早期基因、晚期基因和1個(gè)不翻譯的上游調(diào)節(jié)區(qū)3部分組成。早期基因編碼E1～E7共7個(gè)早期蛋白，主要參與病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯調(diào)控及細(xì)胞轉(zhuǎn)化。其中E6和E7基因能使細(xì)胞從正常向惡性轉(zhuǎn)化，其蛋白產(chǎn)物具有干擾抑癌基因的功能。E6能結(jié)合P53，并促進(jìn)其降解。E7能結(jié)合并拮抗抑癌蛋白pRB，從而干擾其抑制細(xì)胞分裂和增殖的作用。晚期基因L1和L2分別編碼主要衣殼蛋白和次要衣殼蛋白。HPV各型有共同抗原，即屬特異性抗原，存在于L1蛋白，與牛乳頭病毒(bovine papillomavirus，BPV)有交叉反應(yīng)。對(duì)HPV分子生物學(xué)特性的認(rèn)識(shí)為分子診斷奠定了基礎(chǔ)[5]。目前HPV分型方法主要有雜交法和以聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)為基礎(chǔ)的分型法兩大類(lèi)。本文就這兩類(lèi)分型方法作一綜述。

1 雜交法

1.1 直接雜交分析

直接雜交分析是最先用于HPV檢測(cè)的分子診斷方法，包括原位雜交(insituhybridization，ISH)、Southern印跡法、斑點(diǎn)雜交法等。宮頸刮片或活檢標(biāo)本中HPV可應(yīng)用ISH法檢測(cè)，該法和(或)其他標(biāo)志物可對(duì)感染樣品中的HPV單獨(dú)或共同定位，但HPV分型鑒定仍需不同型的特異性探針進(jìn)行多次ISH分析。ISH法測(cè)定HPV的主要缺點(diǎn)是敏感度很低[6]。將HPV DNA從臨床標(biāo)本中直接分離出來(lái)后，采用Southern印跡或斑點(diǎn)雜交進(jìn)行檢測(cè)，達(dá)不到臨床所需靈敏度，且操作繁瑣、費(fèi)時(shí)、耗力、需大量高度純化的DNA，不適合臨床HPV分型的檢測(cè)和大通量臨床樣品的篩查，目前較少使用。

1.2 雜交捕獲法

雜交捕獲法Ⅱ(hybrid captureⅡ，HCⅡ)是美國(guó)Digene公司研究的HPV DNA檢測(cè)技術(shù)，通過(guò)一種非放射性核素(同位素)信號(hào)放大系統(tǒng)，使標(biāo)記的RNA探針結(jié)合HPV DNA，形成DNA-RNA雜交體；后者被微孔板捕獲并與特異性單克隆抗體及化學(xué)發(fā)光底物結(jié)合，堿性磷酸酶作用底物發(fā)光，依據(jù)熒光強(qiáng)度半定量DNA，與熒光實(shí)時(shí)定量PCR法結(jié)果相吻合[7]。該技術(shù)使用2種特異性探針，低危型探針檢測(cè)HPV6、11、42、43和44，高危型探針檢測(cè)HPV16、18、31、33、39、45、51、52、56、59和68，不需要進(jìn)行PCR擴(kuò)增而直接檢測(cè)。HCⅡ?yàn)槟壳拔ㄒ灰陨唐沸问教峁┑那矣凶銐蚩茖W(xué)證據(jù)支持臨床應(yīng)用的檢測(cè)系統(tǒng)，獲美國(guó)食品藥品管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)認(rèn)證，已成為許多國(guó)家的標(biāo)準(zhǔn)方法并廣泛應(yīng)用于臨床研究中。該法的缺點(diǎn)是只能進(jìn)行高危與低危型分組鑒定，而不能進(jìn)行個(gè)體基因分型；兩組混合探針間存在的交叉反應(yīng)也影響檢測(cè)的準(zhǔn)確性[8]。隨著對(duì)HPV研究的深入，需要對(duì)HPV特定基因型進(jìn)行鑒定，該法不能用于如型特異性疫苗或型特異性藥物的研究和療效觀(guān)察。雜交捕獲法Ⅲ(HCⅢ)是Digene公司研制的新一代捕獲雜交法。同樣采用RNA探針技術(shù)，使用一段帶有生物素的寡核苷酸代替特異性抗體，將RNA-DNA雜交體固定在鏈霉素包被的孔中。HCⅢ能特異檢測(cè)出靶序列中單個(gè)核苷酸的改變，從而使HPV基因型變異體的檢測(cè)成為可能。但HCⅢ也是使用混合探針，故不能對(duì)HPV進(jìn)行分型。

2 基于PCR的檢測(cè)方法

PCR是應(yīng)用最廣泛的基因擴(kuò)增方法，具有快速、方便、敏感度高、特異性好的優(yōu)點(diǎn)。檢測(cè)HPV DNA有2種不同的PCR方法，即通用和型特異引物PCR。目前認(rèn)為以PCR為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法是進(jìn)行HPV DNA檢測(cè)及分型的最好方法。

2.1 通用引物PCR

通用引物PCR是使用通用引物來(lái)擴(kuò)增廣譜的HPV，引物針對(duì)HPV基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)。確定這個(gè)保守序列需要來(lái)自每個(gè)HPV型別的許多序列。在HPV基因組中，L1區(qū)最保守[9]。目前有3種不同的通用引物設(shè)計(jì)方案用于擴(kuò)增廣譜HPV DNA：①在基因組保守序列區(qū)設(shè)計(jì)1對(duì)只完全匹配1種或幾種HPV型別的引物，PCR必須在較低的退火溫度下進(jìn)行。②采用一組簡(jiǎn)并引物如MY09/11，PCR也必須在較低的退火溫度下進(jìn)行。該組引物中含有簡(jiǎn)并堿基，因在其合成時(shí)摻入某個(gè)核苷酸有很大的隨機(jī)性，故很難保證各批引物間的均一性，從而影響擴(kuò)增的效率和重復(fù)性。③在基因的同一位置設(shè)計(jì)幾對(duì)正向/反向引物，這些引物不含簡(jiǎn)并堿基但含黃嘌呤，如SPF10、MY09/11及PGMY。因黃嘌呤可與任何堿基匹配，故合成的引物具有較好的重復(fù)性，且PCR可在優(yōu)化的退火溫度下進(jìn)行。因此，無(wú)論對(duì)較新的HPV型別，還是對(duì)已知的生殖道HPV型別，PGMY和SPF10的擴(kuò)增效率要比MY09/11高。此外，待擴(kuò)增片段的大小也影響PCR擴(kuò)增的效率?？偟膩?lái)講，PCR效率隨擴(kuò)增片段的延長(zhǎng)而降低。加之有些臨床標(biāo)本經(jīng)過(guò)醛固定、石蠟包埋等處理后，DNA已遭不同程度的降解，不利于較大片段產(chǎn)物的合成。因此，在上述這些引物中，SPF10擴(kuò)增HPV DNA的效率最高(65 bp)，GP5+/6+次之(150 bp)，PGMY位列第3(450 bp)，MY09/11則列最后(450 bp)[10]。

2.2 型特異引物PCR

應(yīng)用某個(gè)HPV型別的特異性引物檢測(cè)臨床標(biāo)本，必須單獨(dú)進(jìn)行多個(gè)型特異的PCR反應(yīng)。為此Yamaguchi等重新設(shè)計(jì)了通用引物(E6CF4/E7CR3)和5種主要的高危型HPV型特異正向引物，建立了HPV PCR/微量熒光分析法。標(biāo)本中總HPV DNA用該通用引物擴(kuò)增后，經(jīng)SYBR Green Ⅰ染色，以485/538 nm的激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)熒光強(qiáng)度判斷HPV的有無(wú)。若為陽(yáng)性，再用5種型特異引物同時(shí)擴(kuò)增該標(biāo)本中的HPV DNA，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，根據(jù)型特異PCR的片段大小，即可鑒定相應(yīng)基因型；或分別用不同型特異引物擴(kuò)增HPV DNA，再與檢測(cè)總HPV DNA一樣，鑒定標(biāo)本中是否存在特定的HPV型別。該法工作強(qiáng)度大、費(fèi)用昂貴、型特異PCR必須證明有效，而且無(wú)法檢測(cè)新的HPV亞型。

2.3 熒光實(shí)時(shí)定量PCR

熒光實(shí)時(shí)定量PCR是近幾年發(fā)展的技術(shù)，既保持了PCR靈敏、快速的特點(diǎn)，又克服了PCR存在的假陽(yáng)性污染和不能進(jìn)行準(zhǔn)確定量的缺點(diǎn)，此外還有重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便、價(jià)廉等優(yōu)點(diǎn)。目前主要有單通道和多通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR。單通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR在反應(yīng)中使用一種熒光物質(zhì)示蹤，技術(shù)難度相對(duì)較低，但每次反應(yīng)僅能檢測(cè)1個(gè)基因，無(wú)法實(shí)現(xiàn)一次反應(yīng)檢測(cè)多個(gè)基因。在HPV型別分析時(shí)，需重復(fù)對(duì)樣本進(jìn)行多次PCR操作，大大增加了工作量及檢測(cè)成本，因此在HPV感染的臨床應(yīng)用中受到限制。多通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)HPV DNA是通過(guò)多種具有不同激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)的熒光物質(zhì)標(biāo)記或通過(guò)特異性探針示蹤，實(shí)現(xiàn)在同一反應(yīng)管內(nèi)對(duì)不同基因型別的檢測(cè)[11]。目前國(guó)外已有成型試劑盒(AB Analitica的RQ-HPV-PCR試劑盒)上市，經(jīng)國(guó)內(nèi)600例臨床試驗(yàn)研究，特異度達(dá)99.7%，靈敏度為100%，重復(fù)性好；分型的同時(shí)還可準(zhǔn)確定量，結(jié)果直觀(guān)、可靠、客觀(guān)性強(qiáng)，適用于臨床HPV感染篩查和宮頸病變程度預(yù)測(cè)以及患者術(shù)后療效觀(guān)察。

2.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)和分析

對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行的凝膠電泳或測(cè)序分析可用于HPV DNA的檢測(cè)或分型。①PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法：能檢測(cè)所有型別，并可避免雜交反應(yīng)所固有的交叉反應(yīng)，是一種比較可靠的HPV基因分型方法，特別是可檢測(cè)出少見(jiàn)型別或發(fā)現(xiàn)新的型別。但在同時(shí)分析多個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物中不同的DNA序列時(shí)，該法不是十分靈敏，尤其是對(duì)HPV混合感染的臨床樣品。②PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(PCR-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)：用適當(dāng)?shù)南拗菩詢(xún)?nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，產(chǎn)生大小不同的DNA片段，再通過(guò)凝膠電泳分析這些片段，根據(jù)電泳帶型可區(qū)分不同的HPV型別[12,13]。這種方法簡(jiǎn)單、易行，不需特殊昂貴的儀器和設(shè)備，費(fèi)用低。但RFLP對(duì)PCR產(chǎn)物的特異性要求比較高，非特異性條帶的出現(xiàn)會(huì)導(dǎo)致酶切后分型的不確定性；另外還需適當(dāng)?shù)南拗菩詢(xún)?nèi)切酶，對(duì)混合感染的臨床標(biāo)本分析更為復(fù)雜。③PCR的雜交分析：微孔板雜交或反向線(xiàn)性雜交法。將PCR產(chǎn)物同時(shí)與多個(gè)寡核苷酸探針固定在固相上，將其與液相中的PCR產(chǎn)物雜交，通過(guò)一次分析就可同時(shí)檢出若干HPV基因型。因此，雜交分析是最常用的檢測(cè)PCR產(chǎn)物序列的方法。型特異雜交法敏感度較高，一次可檢測(cè)多個(gè)PCR產(chǎn)物，對(duì)多重感染的檢測(cè)能力較高。缺點(diǎn)是只能檢測(cè)已知的常見(jiàn)型，對(duì)未知型及變異型HPV無(wú)法檢測(cè)，且不能排除雜交固有的問(wèn)題(即有交叉雜交存在的可能性)。

3 基因芯片

基因芯片是指采用原位合成或直接點(diǎn)樣的方法將DNA片段或寡核苷酸片段排列在硅片、玻璃等介質(zhì)上形成微矩陣，檢測(cè)樣品用熒光分子標(biāo)記后與微矩陣雜交，通過(guò)熒光掃描及計(jì)算機(jī)分析即可獲得樣品中大量的基因序列及表達(dá)信息，以達(dá)到快速、高效、高通量分析生物信息的目的。國(guó)外HPV DNA芯片可分析15種高危型(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、69)和7種低危型(HPV6、11、34、40、42、43、44)[14,15]，用于宮頸上皮內(nèi)瘤病變或?qū)m頸癌患者的臨床診斷或流行病學(xué)篩查，比細(xì)胞學(xué)方法更敏感、特異、快速。液相芯片體系是美國(guó)Luminex公司開(kāi)發(fā)的一項(xiàng)專(zhuān)利技術(shù)，結(jié)合了流式細(xì)胞技術(shù)及基因芯片技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，主要包括3個(gè)步驟：①探針?lè)肿拥墓潭?；②將這種標(biāo)記好探針的球形基質(zhì)與樣品反應(yīng)，探針可與相應(yīng)的靶分子特異性結(jié)合，帶有綠色熒光的報(bào)告分子也與靶分子特異性結(jié)合，對(duì)反應(yīng)進(jìn)行定量；③反應(yīng)結(jié)果的檢測(cè)。該法具有通量高、速度快、靈活性好、操作簡(jiǎn)便、不需洗滌、耗時(shí)短等特點(diǎn)。理論上Luminex法可檢測(cè)1個(gè)樣本中100種不同目的分子，35～60 min內(nèi)可對(duì)96個(gè)不同的樣本進(jìn)行檢測(cè)，靈敏度高、信噪比好，只需微量樣品即可檢測(cè)，且價(jià)格低廉，可廣泛用于大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查、臨床樣本篩查、治療干預(yù)監(jiān)視和疫苗效果評(píng)價(jià)[16,17]。

4 結(jié)語(yǔ)

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，HPV分型方法不斷涌現(xiàn)，好的方法要有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性好、價(jià)格低廉和客觀(guān)性強(qiáng)等特點(diǎn)。由于不同分型方法有各自的優(yōu)點(diǎn)和不足，可根據(jù)不同需要，選擇合適、有效的分型方法滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)要求。HCⅡ檢測(cè)方法雖然成熟，但靈敏度不高且有較高的漏檢率等，需進(jìn)一步完善。常規(guī)PCR需制樣、擴(kuò)增及檢測(cè)等步驟，費(fèi)時(shí)又費(fèi)力。熒光實(shí)時(shí)定量PCR特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好，分型的同時(shí)還可準(zhǔn)確定量，結(jié)果直觀(guān)、可靠。PCR擴(kuò)增后進(jìn)行測(cè)序和RFLP不僅可檢測(cè)具體型別，還可檢測(cè)所有型別，作一定改進(jìn)后有較大的發(fā)展前景。HPV DNA芯片因具備快速、高效、高通量的分析能力，可廣泛用于大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查、臨床標(biāo)本篩查、治療干預(yù)監(jiān)視和疫苗效果評(píng)價(jià)。

[1] Villa LL, Costa RL, Petta CA, Andrade RP, Paavonen J, Iversen OE, Olsson SE, H?ye J, Steinwall M, Riis-Johannessen G, Andersson-Ellstrom A, Elfgren K, Krogh G, Lehtinen M, Malm C, Tamms GM, Giacoletti K, Lupinacci L, Railkar R, Taddeo FJ, Bryan J, Esser MT, Sings HL, Saah AJ, Barr E. High sustained efficacy of a prophylactic quadrivalent human papillomavirus types 6/11/16/18 L1 virus-like particle vaccine through 5 years of follow-up [J]. Br J Cancer, 2006, 95 (11)：1459-1466.

[2] Moore DH. Cervical cancer [J]. Obstet Gynecol, 2006, 107(5)：1152-1161.

[3] Smith EM, Parker MA, Rubenstein LM, Haugen TH, Hamsikova E, Turek LP. Evidence for vertical transmission of HPV from mothers to infants [J]. Infect Dis Obstet Gynecol, 2010. doi:10.1155/2010/326369.

[4] Matsumoto K. Human papillomavirus and cervical cancer [J]. Nippon Rinsho, 2007, 65(11): 2113-2124.

[5] Shepherd LJ, Bryson SC. Human papillomavirus-lessons from history and challenges for the future [J]. J Obstet Gynaecol Can, 2008, 30(11): 1025-1033.

[6] Hesselink AT, van den Brule AJ, Brink AA, Berkhof J, van Kemenade FJ, Verheijen RH, Snijders PJ. Comparison of hybrid capture 2 with in situ hybridization for the detection of high risk human papillomavirus in liquid-based cervical samples [J]. Cancer, 2004, 102(1): 11-18.

[7] Pretet JL, Dalstein V, Monnier-Benoit S, Delpeut S, Mougin C. High risk HPV load estimated by hybrid capture II correlates with HPV16 load measured by real-time PCR in cervical smears of HPV16 infected women [J]. J Clin Virol, 2004, 31(2): 140-147.

[8] Federschneider JM,Yuan L,Brodsky J, Breslin G, Betensky RA, Crum CP. The borderline or weakly positive hybrid capture II HPV test: A statistical and comparative (PCR) analysis [J]. Am J Obstet Gynecol, 2004, 191(3): 757-761.

[9] Jeney C, Takacs T, Sebe A, Schaff Z. Detection and typing of 46 genital human papillomaviruses by the L1F/L1R primer system based multiplex PCR and hybridization [J]. J Virol Methods, 2007, 140(1-2): 32-42.

[10] Brummer O, Hollwitz B, Bohmer G, Kühnle H, Petry KU. Human papillomavirus-type persistence patterns predict the clinical outcome of cervical intraepithelial neoplasia [J]. Gynecol Oncol, 2006, 102(3): 517-522.

[11] Moberg M, Gustavsson I, Gyllensten U. Real-time PCR-based system for simultaneous quantification of human papillomavirus types associated with high risk of cervical cancer [J]. J Clin Microbiol, 2003, 41(7): 3221-3228.

[12] Santiago E, Camacho L, Junquera ML, Vázquez F. Full HPV typing by a single restriction enzyme [J]. J Clin Virol, 2006, 37(1): 38-46.

[13] Nobre RJ, de Almeida LP, Martins TC. Complete genotyping of mucosal human papillomavirus using a restriction fragment length polymorphism analysis and an original typing algorithm [J]. J Clin Virol, 2008, 42(1): 13-21.

[14] Piao JY, Park EH, Choi K, Quan B, Kang DH, Park PY, Kim DS, Chung DS. Direct visual detection of DNA based on the light scattering of silica nanoparticles on a human papillomavirus DNA chip [J]. Talanta, 2009, 80(2): 967-973.

[15] Brandstetter T, B?hmer S, Prucker O, Bissé E, zur Hausen A, Alt-M?rbe J, Rühe J. A polymer-based DNA biochip platform for human papillomavirus genotyping [J]. J Virol Methods, 2010, 163(1): 40-48.

[16] Schmitt M, Bravo IG, Snijders PJ, Gissmann L, Pawlita M, Waterboer T. Bead-based multiplex genotyping of human papillomaviruses [J]. J Clin Microbiol, 2006, 44(2): 504-512.

[17] Jiang HL, Zhu HH, Zhou LF, Chen F, Chen Z. Genotyping of human papillomavirus in cervical lesions by L1 consensus PCR and the Luminex xMAP system [J]. J Med Microbiol, 2006, 55(6): 715-720.