谷輝杰 鞏倫理 張昀 尹爍 常江 崔磊

·論著·

鎂黃長石浸提液影響人脂肪干細(xì)胞增殖和成骨分化的實(shí)驗(yàn)研究

谷輝杰 鞏倫理 張昀 尹爍 常江 崔磊

目的通過探討不同濃度鎂黃長石浸提液對(duì)人脂肪干細(xì)胞（Human adipose-derived stem cells，hADSCs）增殖和成骨分化的影響，初步闡明鎂黃長石體外促進(jìn)hADSCs成骨分化的機(jī)制。方法依照ISO/EN 10993-5標(biāo)準(zhǔn)，制備鎂黃長石浸提液，將獲得的hADSCs培養(yǎng)于不同濃度的浸提液中(1/2、1/4、1/8、1/16、1/32)，利用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況；在成骨誘導(dǎo)條件下，通過堿性磷酸酶染色、活性檢測(cè)和茜素紅染色以及鈣離子定量檢測(cè)，觀察不同濃度浸提液對(duì)hADSCs成骨特性的影響。結(jié)果1/2、1/4、1/8濃度的浸提液可以濃度依賴性地抑制hADSCs的體外增殖；1/4、1/8、1/16濃度的浸提液可以促進(jìn)hADSCs的體外成骨分化；堿性磷酸酶染色和活性檢測(cè)、茜素紅染色和鈣離子定量檢測(cè)顯示，1/4濃度的浸提液對(duì)hADSCs的體外成骨分化促進(jìn)作用最強(qiáng)，此時(shí)的鈣、鎂和硅離子濃度分別為：2.36 mM、1.11 mM和1.03 mM。結(jié)論鎂黃長石浸提液中的離子在適當(dāng)濃度時(shí)，可以抑制hADSCs的體外增殖，同時(shí)促進(jìn)hADSCs的體外成骨分化。

人脂肪干細(xì)胞 增殖 成骨分化 鎂黃長石 浸提液

骨組織工程為骨缺損，特別是由原發(fā)腫瘤切除、 外傷、手術(shù)切除和矯形導(dǎo)致的臨界大小骨缺損的修復(fù)和再生提供了新的治療策略[1-2]。骨組織工程最基本的概念是將特定的細(xì)胞和合適的支架材料復(fù)合，在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境條件下構(gòu)建新的骨組織，然后用構(gòu)建的骨組織修復(fù)骨缺損。用于骨組織工程的理想的人工合成生物材料支架必須具有以下一些特征：①足夠的生物力學(xué)強(qiáng)度；②良好的生物相容性（包括骨連接性和骨誘導(dǎo)性等）；③可控的生物降解性；④三維多孔立體結(jié)構(gòu)；⑤良好的可塑性；⑥可以消毒滅菌但不損失生物相容性；⑦降解產(chǎn)物沒有毒副作用。生物陶瓷，如磷酸三鈣和羥基磷灰石以及生物玻璃、透輝石和鎂黃長石等[3-4]可以滿足骨組織工程支架的大部分要求，從而廣泛地應(yīng)用于臨床骨缺損的修復(fù)和治療[2-3]。

鎂黃長石（Ca2MgSi2O7）是一種含有鈣、鎂和硅的生物活性陶瓷，具有足夠的力學(xué)強(qiáng)度、可控的降解速度、三維多孔結(jié)構(gòu)和良好的生物相容性[4-6]，使其能夠滿足骨組織工程對(duì)細(xì)胞支架要求，從而在骨組織工程方面具有廣闊的應(yīng)用前景。我們先前的研究表明，相對(duì)于β-TCP，鎂黃長石能夠促進(jìn)hADSCs在體外的成骨分化[7]。此外，Sun等[8]的研究表明，鎂黃長石可以促進(jìn)BMSCs在體外的細(xì)胞增殖和成骨分化。這些研究證明，鎂黃長石具有良好的促進(jìn)成體干細(xì)胞成骨分化的能力，但是調(diào)控這一過程的機(jī)制尚未闡明。

大量的證據(jù)表明，生物材料溶解出的離子能夠促進(jìn)成體干細(xì)胞細(xì)胞外礦化基質(zhì)的形成，已有文獻(xiàn)報(bào)道從陶瓷中析出的Ca、Si離子可以促進(jìn)成骨細(xì)胞系的增殖和成骨相關(guān)基因的表達(dá)[9-10]。同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)在材料中添加Mg離子可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的粘附和增殖[11]。因此，鎂黃長石支架促進(jìn)hADSCs成骨分化是否由其析出的離子導(dǎo)致，以及促進(jìn)成骨這一過程的分子機(jī)制等方面有必要進(jìn)行深入研究。

本實(shí)驗(yàn)研究中，我們利用不同稀釋濃度的鎂黃長石浸提液來探討Ca、Mg、Si離子對(duì)hADSCs的增殖和成骨分化的影響。希望可以闡明Ca、Mg和Si離子對(duì)hADSCs成骨分化的聯(lián)合作用，為設(shè)計(jì)開發(fā)更好的用于骨組織工程的支架材料提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及儀器

Ⅰ型膠原酶 （Washington Biochemical公司）；LG-DMEM（Gibco公司）；FBS（Hyclone公司）；紅細(xì)胞裂解液、1,25-dihydroxyvitamin D3、β-glycerophosphate、茜素紅染料、ALP染色試劑盒、PNP、p-nitrophenol(PNP)phosphate substrate、MTT；鈣離子檢測(cè)試劑盒（BioAssay Systems公司）。Varioskan全波段酶標(biāo)儀 （Thermo Electron公司）；TE300型倒置相差顯微鏡（Nikon公司）。

1.2 hASCs的分離培養(yǎng)

新鮮人脂肪組織來源于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科接受腹部脂肪抽吸術(shù)的健康女性，共5名，平均年齡30周歲。所有操作均獲得上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)認(rèn)可。按照文獻(xiàn)描述分離培養(yǎng)hADSCs[12-13]，即脂肪抽吸獲得物以等體積0.1 M PBS（pH 7.4）清洗3遍，以0.075%的Ⅰ型膠原酶37℃振蕩（120 r/min）條件下消化60 min，含10%FBS的LG-DMEM培養(yǎng)液終止消化，1 200 g離心10 min，獲得高密度間質(zhì)組織細(xì)胞團(tuán)，并以紅細(xì)胞裂解液處理5 min，除去摻雜的紅細(xì)胞，過直徑100 μm的篩網(wǎng)，以除去未完全消化的組織。所獲得細(xì)胞以生長培養(yǎng)液重懸（GM：LG-DMEM，10%FBS，100 mg/mL鏈霉素，100 U/mL青霉素），4×104cells/cm2接種于直徑100 mm的培養(yǎng)皿中，37℃、5%CO2、100%濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)，每周換液2次。當(dāng)細(xì)胞長至70%～80%融合時(shí)，以1∶3的比例傳代。選用第3～5代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 鎂黃長石浸提液的制備

應(yīng)用溶膠—凝膠法制備鎂黃長石粉體[6]，依照ISO/EN 10993-5的浸提液制備標(biāo)準(zhǔn)[14]，將鎂黃長石粉體加入到LG-DMEM培養(yǎng)液中進(jìn)行制備，即：將鎂黃長石粉體以200∶1的質(zhì)量體積比（mg/mL）加入LG-DMEM的培養(yǎng)液中，37℃孵育24 h，將上述懸濁液高速離心，上清以0.22 μm的濾紙過濾消毒，以0.1 M的鹽酸溶液調(diào)整pH值到7.4±0.5。得到的浸提液加入10%FBS作為初始浸提液。初始浸提液被GM培養(yǎng)液稀釋X倍后記作“1/x浸提液”，用于之后的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)液中的Ca、Si、Mg離子濃度由電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法 （ICP-AES，Varian Co.）測(cè)得（表1）。

表1培養(yǎng)液中的Ca、Si、Mg離子濃度(mM)

1.4 成骨誘導(dǎo)方案

hADSCs以3×104cells/cm2密度接種，24 h后換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液（OM：生長培養(yǎng)液或不同稀釋濃度的浸提液，0.01 μM 1,25-dihydroxyvitamin D3，50 μM ascorbate-2-phosphate，10 mM β-glycerophosphate）進(jìn)行培養(yǎng)。

1.5 細(xì)胞活性檢測(cè)

將hADSCs按1 000個(gè)/孔接種于96孔板中，待24 h細(xì)胞貼壁后吸出原來的培養(yǎng)液，加入對(duì)應(yīng)稀釋倍數(shù)的浸提液100 μL代替。以GM培養(yǎng)液作為對(duì)照組。細(xì)胞培養(yǎng)1 d、3 d和7 d后，每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)的培養(yǎng)液。每孔中加入150 μL二甲基亞砜（DMSO），置于搖床上低速震蕩10 min，然后將液體移入另一新的96孔板中，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD 490 nm處測(cè)量各孔吸光值。

1.6 堿性磷酸酶（ALP）染色及定量檢測(cè)

依照Sigma Diagnostic Kit 85對(duì)成骨誘導(dǎo)后的hADSCs進(jìn)行ALP染色。進(jìn)行ALP的活性定量檢測(cè)時(shí)，首先以冰凍PBS清洗細(xì)胞培養(yǎng)層，每孔加入1 mL細(xì)胞裂解液，以細(xì)胞刮子徹底刮下細(xì)胞層，移入1.5 mL離心管中，冰浴條件下以組織勻漿儀超聲勻漿45 sec（每次連續(xù)超聲5 sec，間隔5 sec）[15]。在4℃條件下12 000 r/min離心10 min，小心吸取上層蛋白溶液。移取0.1 mL蛋白溶液至15 mL離心管中，每管加入0.5 mL p-nitrophenol(PNP)phosphate底物溶液和0.5 mL堿性緩沖液，封蓋，37℃溫育15 min，每管加入1 mL 0.5 N NaOH溶液終止反應(yīng)。移取200 μL反應(yīng)終止液于透明96孔板中，以全波段酶標(biāo)儀（Varioskan，Thermo Electron Corp.，USA）讀取405 nm吸光值。另以PNP粉體制得不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)PNP溶液，讀取405 nm吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過比對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到各反應(yīng)終止液中PNP的含量。同時(shí)以BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒測(cè)定各勻漿液中總蛋白的含量。細(xì)胞的ALP活性均以其總蛋白的含量進(jìn)行歸一，表示為nmol PNP/min/mg total protein，未接種細(xì)胞的板孔進(jìn)行相同處理，其值作為空白對(duì)照值從以上所測(cè)的每個(gè)實(shí)驗(yàn)值中減去。

1.7 細(xì)胞外鈣沉積檢測(cè)

茜素紅染色[16]：hADSCs成骨誘導(dǎo)一定時(shí)間后進(jìn)行茜素紅染色，95%乙醇固定10 min，PBS清洗2遍，1%茜素紅-Tris-HCl溶液（pH 4.2）室溫染色30 min，PBS徹底清洗，倒置相差顯微鏡觀察、拍照。

細(xì)胞外鈣沉積定量檢測(cè)：接種于6孔板的細(xì)胞成骨誘導(dǎo)一定時(shí)間后，吸去培養(yǎng)液，用無鈣、鎂的PBS洗2遍，然后每孔加入0.1 N的鹽酸1 mL，4℃作用4 h，吸取上清，12 000 r/min離心 5 min，依據(jù)QuantiChrom Calcium Assay Kit （BioAssay Systems Hayward，CA）說明書測(cè)定上清中鈣離子的含量。收集細(xì)胞以BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒測(cè)定各孔中蛋白的含量。細(xì)胞外鈣沉積均以其總蛋白的含量進(jìn)行歸一，表示為μg/mg total protein。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3遍，數(shù)據(jù)以（均值±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，采用方差齊性的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)軟件為SPSS 11.0，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 浸提液對(duì)hADSCs增殖的影響

浸提液抑制hADSCs的增殖活性具有濃度依賴性。細(xì)胞接種后1 d、3 d和7 d后，MTT法檢測(cè)顯示，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，在各個(gè)稀釋倍數(shù)浸提液中培養(yǎng)的細(xì)胞均有增殖，接種后1 d、3 d各組細(xì)胞增殖與對(duì)照組沒有顯著差別。第7天時(shí)，隨著浸提液濃度的增加，細(xì)胞增殖受到明顯的抑制（圖1）。在濃度為1/2的浸提液中，細(xì)胞增殖被抑制了40%，隨著浸提液濃度的降低，抑制逐漸減輕，當(dāng)浸提液濃度為1/16和1/32時(shí)，未觀察到明顯的細(xì)胞增殖抑制情況。

圖1 浸提液對(duì)hADSCs活性的影響

2.2 浸提液對(duì) hADSCs成骨過程中堿性磷酸酶（ALP）活性的影響

浸提液呈濃度依賴性促進(jìn)hADSCs成骨過程中ALP的活性。體外培養(yǎng)10 d后進(jìn)行ALP的染色觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組（OM）的ALP染色陽性，不同濃度浸提液對(duì)hADSCs的成骨分化有促進(jìn)作用，在1/4濃度時(shí)成骨促進(jìn)作用最明顯（圖2A）。ALP定量結(jié)果顯示，體外成骨誘導(dǎo)條件下，與OM組比較，1/4組和1/8組分別促進(jìn)了堿性磷酸酶表達(dá)的78.2%和18.8%（圖2B）。

2.3 浸提液促進(jìn)細(xì)胞外鈣沉積

體外培養(yǎng)14 d后進(jìn)行茜素紅染色觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組（OM）細(xì)胞外基質(zhì)鈣特異性染色深，可見散在的鈣結(jié)節(jié)。1/2組細(xì)胞外鈣結(jié)節(jié)較對(duì)照組（OM）明顯減少，在1/4～1/32組，隨著浸提液濃度的增高，鈣結(jié)節(jié)數(shù)量和大小逐漸增多。鈣離子的定量檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組（OM）相比，1/2和1/32組無明顯差異，1/4組、1/8組和1/16組的細(xì)胞外鈣沉積分別增加了72.3%、23.4%和18.6%（圖3B）。

圖2 浸提液對(duì)于促進(jìn)成骨誘導(dǎo)的hADSCs的ALP表達(dá)具有劑量依從性

圖3 浸提液對(duì)于促進(jìn)成骨誘導(dǎo)的hADSCs的細(xì)胞外鈣沉積具有劑量依從性

3 討論

鎂黃長石是一種由鈣、鎂和硅組成的生物陶瓷，以往的研究已經(jīng)成功制備了鎂黃長石粉體[5-6]。當(dāng)把鎂黃長石浸泡在模擬體液中的時(shí)候，可檢測(cè)出釋放的可溶性鈣、鎂和硅離子，同時(shí)也可觀察到表面形成的類骨質(zhì)羥基磷灰石層[5]。我們?cè)缙谘芯勘砻?，接種于鎂黃長石陶瓷片表面的hADSCs較之接種于TCP表面的hADSCs有更強(qiáng)的成骨分化能力[7]。但是，鎂黃長石促進(jìn)hADSCs成骨分化的具體機(jī)制仍然不清楚，很難區(qū)分這種促進(jìn)成骨分化的能力是由鎂黃長石溶解出的鈣、鎂和硅等活性離子引起的，還是由材料表面的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)引起的。因此，為了闡明活性離子促進(jìn)成骨誘導(dǎo)的作用，我們制備了鎂黃長石的浸提液，并研究不同稀釋濃度浸提液（1/2、1/4、1/8、1/16、1/32）對(duì)hASCs的增殖和成骨分化的影響。

已有研究表明，鎂黃長石浸提液中的鈣、鎂和硅離子在某一濃度范圍內(nèi)能夠促進(jìn)BMSCs、骨母細(xì)胞和L929細(xì)胞的增殖[5-6]。本研究發(fā)現(xiàn)，鎂黃長石浸提液抑制hADSCs的增殖，且這種抑制作用具有濃度依賴性。我們認(rèn)為，這種現(xiàn)象可能是由于不同細(xì)胞對(duì)離子濃度的反應(yīng)不一樣導(dǎo)致的。同時(shí)我們也發(fā)現(xiàn)，高濃度的浸提液（1/2、1/4）并沒有完全抑制hADSCs細(xì)胞的增殖作用，而細(xì)胞的成骨分化和細(xì)胞的增殖是一個(gè)平衡過程，高濃度浸提液對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用可能是由于其促進(jìn)了細(xì)胞的成骨分化。

骨組織工程支架材料維持并促進(jìn)細(xì)胞的成骨能力，是應(yīng)用組織工程方法修復(fù)骨缺損的關(guān)鍵之一。本研究中，我們觀察了還有鈣、鎂和硅離子的鎂黃長石浸提液對(duì)hADSCs成骨分化的影響。我們發(fā)現(xiàn)浸提液可以促進(jìn)hADSCs成骨分化，且這個(gè)促進(jìn)作用具有濃度依賴性，當(dāng)浸提液的濃度為1/4時(shí)，其中的鈣、鎂和硅離子濃度分別為2.36 mM、1.11 mM和1.03 mM，對(duì)hADSCs的成骨分化促進(jìn)作用最明顯，該結(jié)果和單個(gè)離子對(duì)細(xì)胞成骨分化作用結(jié)果是一致的。向培養(yǎng)液中添加鈣離子或是從材料中析出的鈣離子可以促進(jìn)BMSCs、骨母細(xì)胞的體外成骨分化和礦質(zhì)沉積[9,17]。已經(jīng)證明硅在礦質(zhì)結(jié)節(jié)的形成和Ⅰ型膠原、葡萄糖胺聚糖的合成中起重要作用[18-19]。鎂是機(jī)體的一種重要無機(jī)元素，鎂在細(xì)胞分化和血管組織鈣化過程中發(fā)揮重要作用[11,20]。鎂離子的缺乏可以引起骨形成障礙[21]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，鈣、鎂和硅離子聯(lián)合作用可以促進(jìn)hADSCs的成骨分化。

綜上所述，鎂黃長石浸提液可以抑制hADSCs的增殖能力，且這種抑制具有濃度依賴性，濃度越大，抑制效果越明顯。同時(shí)，鎂黃長石浸提液可以促進(jìn)hADSCs的成骨分化，這種促進(jìn)同樣具有濃度依賴性，當(dāng)浸提液濃度為1/4時(shí)促進(jìn)效果最明顯。值得注意的是，浸提液在1/2濃度時(shí)對(duì)hADSCs增殖的抑制最明顯，而對(duì)hADSCs的成骨分化沒有明顯的促進(jìn)作用。我們的增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果和以往關(guān)于BMSCs等細(xì)胞研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相反，提示不同的細(xì)胞對(duì)離子的反應(yīng)不同。我們的研究證實(shí)了材料可以通過析出離子來影響細(xì)胞的增殖和分化，但其具體作用機(jī)制尚不清楚，需要進(jìn)一步研究。同時(shí)，材料是否通過其他方式影響細(xì)胞的生物行為也需要進(jìn)一步研究，以求闡明材料和細(xì)胞相互作用的機(jī)制，為骨組織工程的臨床治療提供理論依據(jù)。

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Experimental Study on the Effect of Extracts of Akermanite on Proliferation and Osteo-Differentiation of Human Adipose-Derived Stem Cells

GU Huijie1,GONG Lunli1,ZHANG Yun1,YIN Shuo2,CHANG Jiang3,CUI Lei1,2.

1 Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People′s Hospital,Shanghai 200011, China;2 National Tissue Engineering Research and Development Center, Shanghai 200241, China; 3 Shanghai Institute of Ceramics, Chinese Academy of Science,Shanghai 200050,China.Corresponding author:CUI Lei.

Objective To elucidate the underlying mechanism of the osteo-differentiation of akermanite on human adipose-derived stem cells(hADSCs)via observing the effect of different diluted rate extracts on the proliferation and osteodifferentiation of hDASCs.Methods The original extract was prepared according to the ISO/EN 10993-5 and hDASCs were cultured in the different diluted rate extracts(1/2,1/4,1/8,1/16,1/32).The MTT assay was carried out to quantitatively evaluate the proliferation of the cells.Under the condition of osteo-induction,osteogenic differentiation of hADSCs cultured in the different extracts was detected by ALP expression and calcium deposition.Results The 1/2,1/4,1/8 extracts could concentration-dependently suppress the proliferation of hASCs,while the 1/4,1/8,1/16 extracts could promote the osteogenic differentiation of hADSCs.Among them,the 1/4 extract with the concentration of Ca2+,Mg2+and Si4+were 2.36 mM,1.11 mM, 1.03 mM,has the optimum one.Conclusion The ions in the extract of akermanite can suppress the proliferation of hADSCs while promoting the osteogenic differentiation of hADSCs in a suitable concentration.

Human adipose-derived stem cells(hADSCs);Proliferation;Osteogenic differentiation;Akermanite;Extract

Q813.1+1

A

1673－0364（2010）06－0301－05

2010年7月19日，

2010年9月24日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2010.06.001

國家自然科學(xué)基金（30672190和30730034)。

200011 上海市 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科（谷輝杰，鞏倫理，張昀，崔磊）；200235 上海市 組織工程國家工程研究中心（尹爍，崔磊）；200050 上海市 中國科學(xué)院上海硅酸鹽研究所（常江）。

崔磊。