高文偉,李培英,孫宗玖,張延輝,阿不來(lái)提·阿不都熱依木,黃超凡,李 楠

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆烏魯木齊 830052）

狗牙根（Cynodon dactylon）又名百慕大草、鋪地草,屬禾本科畫眉草亞科虎尾草族,原產(chǎn)于非洲,分布在熱帶、亞熱帶和溫帶沿海地區(qū),是全球暖季型草坪草中坪用價(jià)值最高,應(yīng)用最廣泛的草種之一[1-6]。在我國(guó),狗牙根廣泛分布于新疆和黃河流域及其以南地區(qū)[1,3,5-6]。區(qū)域間引種和國(guó)內(nèi)選育的一些新狗牙根品種,使得目前我國(guó)狗牙根資源之間的親緣關(guān)系模糊,因此有必要對(duì)狗牙根種質(zhì)資源的遺傳多樣性進(jìn)行研究[1-6]。

目前關(guān)于狗牙根的遺傳多樣性的研究主要基于表型性狀的觀測(cè)。張小艾和張新全[4]對(duì)西南區(qū)野生狗牙根的20個(gè)外部形態(tài)指標(biāo)進(jìn)行觀測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)相對(duì)于一個(gè)形態(tài)指標(biāo),材料存在顯著差異,變異系數(shù)范圍較大。但形態(tài)學(xué)性狀易受環(huán)境和人為因素的影響,對(duì)遺傳變異的檢測(cè)有限。近年,對(duì)狗牙根遺傳多樣性的分子標(biāo)記研究也初見報(bào)道,常用的 DNA 分子標(biāo)記有 RFLP、RAPD、AFLP、SSR和ISSR等,它們各有優(yōu)缺點(diǎn)。簡(jiǎn)單序列重復(fù)（simple sequence repeat,SSR）亦稱微衛(wèi)星（microsatellite）技術(shù),是指由2～6個(gè)堿基組成的基本序列串聯(lián)重復(fù)組成的短片段,為共顯性標(biāo)記。由于該技術(shù)具有簡(jiǎn)便、快速、穩(wěn)定性高和等位基因多樣性高等特點(diǎn),在基因組研究中作為一種主要的分子標(biāo)記技術(shù),在玉米（Zea mays）、小麥（Triticum aestivum）、棉花（Gossypium hirsutum）等植物遺傳圖譜的構(gòu)建、比較基因組研究、遺傳多樣性分析和系統(tǒng)學(xué)研究之中的研究應(yīng)用較廣,而在草坪草方面研究較少。

本研究以搜集到的70份新疆狗牙根種質(zhì)資源為材料,采用SSR技術(shù)檢測(cè)狗牙根種質(zhì)資源的遺傳多樣性,分析狗牙根不同居群間的親緣關(guān)系,旨為科學(xué)地保護(hù)和合理地開發(fā)與利用新疆狗牙根種質(zhì)資源及狗牙根的育種研究提供理論依據(jù)。

1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于新疆烏魯木齊市新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)場(chǎng),海拔 850 m,年均溫6.5℃,年極端最高38.8℃,極端最低溫-41.5℃。冬季有積雪,年降水量230 mm,年蒸發(fā)量2 570 mm,土壤結(jié)凍期為11月中旬,解凍期為3月中旬,無(wú)霜期150 d左右。試驗(yàn)前該地多年種植玉米,土壤為荒漠灰鈣土,肥力中等,有灌溉條件。

2 材料與方法

2.1 試驗(yàn)材料供試的狗牙根材料共70份,其中19份來(lái)自新疆農(nóng)業(yè)大學(xué),51份來(lái)自疆內(nèi)各地區(qū)。各材料的采集地見表1。

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1基因組DNA提取 參照傳統(tǒng)CTAB法并進(jìn)行改良,具體方法如下:1）用液氮將研缽預(yù)冷,取200 mg幼嫩葉片,加入液氮快速研磨,研磨至灰白粉末 。2）加入800μ LDNA提取緩沖液、200μ L 10%的 SDS 和 50 μ L β-巰基乙醇 ,放置在振蕩機(jī)上振蕩15～30 s。于65℃水浴30 min,每10 min輕柔搖勻一次。3）取出后加入300 μ L KAC,冰浴 30 min。4）加入 700 μ L 氯仿/異戊醇（24∶1）,緩慢 混勻,12 000 r/min離心10 min,取600 μ L上清液。5）加入等體積異丙醇,于-20℃冷卻 60 min,取出后以 8 000 r/min離心 5 min,棄上清 。6）加入 600 μ L 70%乙醇,洗滌 2～3次。7）晾干,加入 50 μ L TE 緩沖液,溶解后于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 供試材料

2.2.2DNA濃度和純度的檢測(cè) 隨機(jī)選取狗牙根無(wú)性系健康幼葉。用改良CTAB法提取其基因組DNA。用0.8%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度和純度。合格的DNA樣品于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3SSR體系的建立 PCR反應(yīng)體系為10 μ L,其中 :10 ×buffer 2 μ L 、0.2 mmoL/L dNTPs 0.5 μ L 、引物 0.5 μ L 、Taq 酶 0.3 μ L 、雙蒸水 4.7 μ L 、模板 DNA 2 μ L 。

熱反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性2 min,94℃變性45 s,55℃退火45 s,72℃延伸1 min,共做30個(gè)循環(huán),72℃延伸7 min,4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用10%的聚丙稀酰胺凝膠電泳檢測(cè),銀染顯色。

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析SSR分析中,在相同的遷移位置上,有帶賦值1,無(wú)帶賦值0,缺失記為9；建立數(shù)據(jù)庫(kù)。按UPGMA方法進(jìn)行聚類作圖,數(shù)據(jù)處理用NTSYS-pc（V2.1）軟件完成。多態(tài)性信息量（PIC）按Smith等的公式計(jì)算。

式中,fi為i位點(diǎn)的基因頻率。

3 結(jié)果分析

3.1SSR多態(tài)性分析

3.1.1SSR標(biāo)記體系分析 如圖1所示,用改良的CTAB方法提取的狗牙根DNA電泳譜帶,主帶明亮清晰、一致,基本無(wú)降解。

圖1 狗牙根DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

采用新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室確立的適合狗牙根的SSR反應(yīng)體系,本試驗(yàn)SSR-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件和反應(yīng)體系能得到各樣本的譜帶,主帶清晰,易于區(qū)分（圖 2）。因此,該體系能應(yīng)用于狗牙根的SSR-PCR擴(kuò)增分析。

圖2 引物P1擴(kuò)增的SSR帶型

3.1.2SSR標(biāo)記分析 在Genebank中搜出狗牙根的相關(guān)基因片段序列,利用primer5.0及相關(guān)遺傳分析軟件,設(shè)計(jì)出11對(duì)狗牙根的SSR引物對(duì)。以本試驗(yàn)不同類型的狗牙根材料為模板,用11對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行比對(duì)、篩選引物。篩選原則是擴(kuò)增條帶數(shù)較多,條帶清晰的引物,且PIC＞0.5。

本研究初步確定11對(duì)SSR引物多態(tài)性引物。利用篩選的11對(duì)引物對(duì)70份狗牙根供試材料進(jìn)行SSR-PCR擴(kuò)增,共擴(kuò)增出55個(gè)位點(diǎn),每對(duì)引物檢測(cè)到3～6個(gè)等位基因,平均每對(duì)引物檢測(cè)到5個(gè)等位基因。每個(gè)SSR位點(diǎn)的多態(tài)性信息量（PIC）在0.65～0.83,平均 0.78,其中引物 P2、P3、P7位點(diǎn)的 PIC最大（0.83）,P11位點(diǎn)最?。?.65）（表2）。由于這70份材料分別來(lái)源于新疆多個(gè)市（縣）的不同地理位置,代表了研究新疆野生狗牙根的部分區(qū)域,另外也包括少部分優(yōu)選系,但這些優(yōu)選系由于選育時(shí)間較長(zhǎng)又在區(qū)內(nèi)不同地區(qū)之間進(jìn)行交換種植,很難說(shuō)它們遺傳性狀不會(huì)發(fā)生變異。以上結(jié)果表明:新疆野生狗牙根不同居群間,優(yōu)選系的不同居群間存在著復(fù)雜的遺傳背景,也存在著豐富的遺傳多樣性。

表2 狗牙根SSR標(biāo)記的多態(tài)性

3.2 聚類分析根據(jù)狗牙根材料的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖,構(gòu)建引物在不同材料間的基因指紋圖譜和相似系數(shù)矩陣。通過(guò)NTSYS軟件分析70份狗牙根種質(zhì)材料的遺傳多樣性和親緣關(guān)系,聚類分析結(jié)果見圖3。各材料間遺傳相似性系數(shù)為0.50～0.84,均值為0.67。選取 0.55為閾值,70份材料大體上可分為4個(gè)類群。第Ⅰ類群包括48份材料（序號(hào):1-12 、14-19 、27-29、32-42、44、46-51、53-61）,其中新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)有9個(gè)材料,托克遜縣3個(gè),察布查爾縣6個(gè),吐魯番市3個(gè),伊寧市4個(gè),哈密市3個(gè),霍城縣3個(gè),岳普湖縣3個(gè),疏勒縣2個(gè),昌吉市園藝場(chǎng)1個(gè),莎車縣2個(gè),喀什市2個(gè),澤普縣、阿克陶縣、英吉沙縣、庫(kù)爾勒市、鄯善縣、博樂(lè)市、葉城縣各1個(gè)；各材料間遺傳相似性系數(shù)為0.56～0.84,均值為0.70；該類群采集地的生態(tài)環(huán)境為近水邊或冷涼多水區(qū)域,葉片類型為寬葉匍匐類型。第Ⅱ類群包括13份材料（序號(hào):13、20-26 、30、31、43、45、52）,其中阿圖什3個(gè),吐魯番市2個(gè),呼圖壁縣2個(gè),托克遜縣3個(gè)和烏蘇市、昌吉市、新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)各1個(gè)；各材料間遺傳相似性系數(shù)為 0.57～0.78,均值為0.68；該類群采集地的生態(tài)環(huán)境為近荒漠或干旱缺水區(qū)域,葉片類型為窄葉直立類型。第Ⅲ類群1份材料,來(lái)自新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)優(yōu)選系材料（序號(hào):62）,與第Ⅳ類群間遺傳相似性系數(shù)為0.54。第Ⅳ類群8份材料,來(lái)自新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)優(yōu)選系材料（序號(hào):63-70）,各材料間遺傳相似性系數(shù)為0.58～0.72,均值為0.65。第Ⅲ、Ⅳ類群為從資源圃中選擇的自然變異類型,因此,與前2類有明顯的差異。由此可見,SSR標(biāo)記聚類結(jié)果與狗牙根材料的地理來(lái)源有一定的相關(guān)性,資源遺傳關(guān)系與生態(tài)分區(qū)間有明顯的聯(lián)系,即在自身進(jìn)化傳播過(guò)程中,在某一生態(tài)環(huán)境下,狗牙根經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期自然、人工選擇和改良后,在遺傳結(jié)構(gòu)上發(fā)生了能夠區(qū)別于其他生態(tài)區(qū)資源的變異。同時(shí)也說(shuō)明了在新疆境內(nèi)的狗牙根資源中,各地區(qū)的狗牙根材料有一定的遺傳相似性,但是又相對(duì)獨(dú)立,如在4類中每一類都有1個(gè)較為獨(dú)立的狗牙根材料,如第Ⅰ類群中的3號(hào)材料、第Ⅱ類群中的20號(hào)材料、第Ⅲ類群中的62號(hào)材料、第Ⅳ類群中的70號(hào)材料。還有通過(guò)新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)的優(yōu)選系材料來(lái)看,優(yōu)選系間遺傳差異不大的原因可能與長(zhǎng)期的系統(tǒng)選擇有關(guān)。

4 討論與結(jié)論

圖3 70份狗牙根的UPGMA聚類樹狀圖

由于狗牙根屬是一個(gè)種類繁多,形態(tài)變異復(fù)雜,含有二倍體、三倍體、四倍體和六倍體的多年生禾草,無(wú)論是從形態(tài)學(xué)還是細(xì)胞學(xué)水平上進(jìn)行的分類都是受幾個(gè)形態(tài)特征或生理生化特性的基因控制,它們?cè)谠撐锓N遺傳信息中所占比例很小,所以這些分類都有其局限性。因此,狗牙根屬分類很困難,至今沒(méi)有一個(gè)完善的分類方法[2-3]。近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的分子標(biāo)記技術(shù)可以對(duì)基因組的所有序列直接分析,檢測(cè)基礎(chǔ)序列的變化,在DNA水平上揭示群體的遺傳變異,所以利用分子標(biāo)記指紋圖譜建立的UPGMA系統(tǒng)樹可以反映種內(nèi)或種間關(guān)系、居群間關(guān)系和基因組間的關(guān)系[1-15]。

本研究表明,11對(duì)引物在70份材料之間均具有多態(tài)性,每個(gè)SSR位點(diǎn)的多態(tài)性信息量（PIC）在0.65～0.83,平均0.78。狗牙根基因組DNA多態(tài)性明顯偏高的特點(diǎn),可以進(jìn)一步證實(shí)眾多研究者從生態(tài)等角度發(fā)現(xiàn)的狗牙根種內(nèi)擁有大量可供遺傳變異選擇的基因型,這些豐富的遺傳變異的存在,正是狗牙根能形成眾多品種（系）的分子基礎(chǔ)[3,5-6,10,15]。聚類分析表明,新疆境內(nèi)的狗牙根資源中,各地區(qū)的狗牙根材料有一定的遺傳相似性,但又相對(duì)獨(dú)立。70份材料聚為4類群,其中Cd071（序號(hào):62）單獨(dú)聚成 1類,野生材料聚為2類；新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)優(yōu)選系（序號(hào):63-70）聚為1類。這種聚類不完全符合地域性分布規(guī)律的原因可能有2個(gè)方面:一是基因突變物種在進(jìn)化過(guò)程中,有個(gè)別的基因發(fā)生了變異,且該突變體能較好地適應(yīng)當(dāng)?shù)氐沫h(huán)境,這個(gè)變異基因就能得到保存；二是以狗牙根頑強(qiáng)的無(wú)性繁殖能力,流水沖刷和人類活動(dòng)等都可能使其轉(zhuǎn)入異地?cái)U(kuò)展繁殖。這就要求在收集、保護(hù)狗牙根種質(zhì)資源時(shí),應(yīng)盡量保證其生態(tài)和地理環(huán)境的多樣性。鑒于狗牙根是異花授粉植物,在廣泛收集種質(zhì)資源的同時(shí),一定要注意采取不同措施進(jìn)行種質(zhì)隔離,避免傳粉引起種質(zhì)資源混淆。

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