沈京群,劉殿閣

(東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院腎內(nèi)科,江蘇南京 210009)

腎臟纖維化是腎臟疾病進(jìn)展至終末期腎衰竭必經(jīng)之路,主要表現(xiàn)為腎小球硬化及腎間質(zhì)纖維化,病理特征是腎間質(zhì)毛細(xì)血管喪失及細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)過(guò)度積聚,但腎臟ECM重塑過(guò)程發(fā)生機(jī)制尚未完全明確。Ets作為轉(zhuǎn)錄因子,具有多種生物學(xué)功能,與編碼蛋白酶的啟動(dòng)基因相互作用,包括基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)及尿纖溶酶原激活物(u-PA),并且能提高這些基因的啟動(dòng)活性,在多種纖維化疾病中發(fā)揮重要作用[1-2]。作者就近年來(lái)轉(zhuǎn)錄因子Ets在腎臟基質(zhì)重塑中作用的研究進(jìn)展作一綜述。

1 Ets基因的發(fā)現(xiàn)

美國(guó)馬里蘭州的Frederic國(guó)家癌癥研究所在研究禽類反轉(zhuǎn)錄病毒E26時(shí)發(fā)現(xiàn)了癌基因v-ets。E26為禽類白血病病毒,是一個(gè)復(fù)制缺陷的反轉(zhuǎn)錄病毒,該病毒轉(zhuǎn)錄一個(gè)5.7 kb RNA,并編碼了一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為135的三聯(lián)核內(nèi)磷酸蛋白,即一個(gè)v-ets的序列結(jié)合了濾過(guò)性病毒的gag基因和癌基因v-myb。隨后,一系列細(xì)胞Ets基因被發(fā)現(xiàn),都與E26擁有高度保守的同源序列,可決定基因結(jié)構(gòu)、識(shí)別開(kāi)放閱讀框及編碼特定蛋白。因此,根據(jù)E26(E-twenty-six)的英文縮寫而將該基因命名為Ets。Ets家族屬轉(zhuǎn)錄因子,依據(jù)Ets結(jié)構(gòu)域的同源性,將Ets基因家族分為幾個(gè)亞族,主要包括Ets-1、Ets-2、Erg-2、Fli-1、Fev、GABPα、TEL(ETV6)等20多種成員[2]。

2 Ets家族的調(diào)控機(jī)制

Ets家族作為細(xì)胞內(nèi)最大的信號(hào)依賴轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子家族之一,存在復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制,歸納起來(lái)包括以下幾種:(1)分子內(nèi)調(diào)控機(jī)制。Ets-1和Ets-2氨基末端存在一個(gè)特殊的抑制序列,可以抑制其與DNA的結(jié)合。這種抑制作用在蛋白質(zhì)和一些輔助因子結(jié)合后被解除,因此這些輔助因子作為此類蛋白質(zhì)的激活因子發(fā)揮作用。(2)組合調(diào)控機(jī)制。Ets蛋白調(diào)控不同組織和細(xì)胞的多種基因表達(dá)。組合調(diào)控是Ets家族特征之一,其中包括與其它一些關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的相互作用[3]。(3)Ets調(diào)控的基因所結(jié)合的蛋白質(zhì)與其它蛋白質(zhì)相結(jié)合,在溶液中形成穩(wěn)定的多亞基復(fù)合物。(4)生長(zhǎng)調(diào)控因子在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控水平及蛋白質(zhì)穩(wěn)定性水平影響Ets蛋白的活性,如有絲分裂信號(hào)改變Ets-1與Ets-2磷酸化狀態(tài),從而抑制其與DNA的結(jié)合能力,故有絲分裂信號(hào)可以抑制Ets-1及Ets-2的活性;另外,v-ets通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1(activator protein 1,AP-1)激活基質(zhì)降解酶和膠原酶的啟動(dòng)子,這可能與一些內(nèi)原性基因如Fos和Jun的激活有關(guān)[4-5]。

3 轉(zhuǎn)錄因子Ets信號(hào)傳導(dǎo)

轉(zhuǎn)錄因子Ets對(duì)靶基因的調(diào)控作用由復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)組成,在信號(hào)傳導(dǎo)通路中,Ets家族中有兩個(gè)重要的亞家族已被進(jìn)行了深入研究,一是Ets,包括Ets-1、Ets-2和Pointed(Pt2),該組基因都包括C末端保守的DNA結(jié)合域和N末端的Pointed域并且含有一個(gè)距Pointed域比較近的MAPK磷酸化位點(diǎn)[6];第二個(gè)是三重復(fù)合物因子(ternary complex factors,TCFs),包括Elk1、Sap1a、Sap1b、Fli-1和NetTCF,含有多個(gè)絲蘇氨酸殘基的磷酸化位點(diǎn),磷酸化后可以增強(qiáng)其激活轉(zhuǎn)錄功能[7-8]。MAPK信號(hào)通路的ERK1/2、p38和JNK將外部刺激傳到核內(nèi),激活數(shù)種因子,引起下游基因表達(dá)的變化[9]。這些信號(hào)傳導(dǎo)通路的下游轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子包括Ets家族,Ets轉(zhuǎn)錄因子家族激活后對(duì)特定基因表達(dá)的調(diào)節(jié)是通過(guò)與其它種類的轉(zhuǎn)錄因子在DNA組件上形成某種特異的復(fù)合物得以實(shí)現(xiàn)[10-11]。Ca2+依賴的信號(hào)通路和MAPK一樣可以通過(guò)磷酸化而控制Ets-1活性。Ca2+依賴性磷酸化位點(diǎn)在Ets-1的DNA結(jié)合域附近第7外顯子編碼區(qū)的6個(gè)絲氨酸殘基上,Ca2+特異性的磷酸化作用增加Ets-1折疊構(gòu)象的穩(wěn)定性而阻斷其與DNA結(jié)合。此外,Ets家族成員通過(guò)作用于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)受體在TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起重要作用[12]。血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)作用于AT1受體激活下游信號(hào)通路,可以調(diào)控Ets的功能,提高了在腎小球系膜細(xì)胞Ets-1轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)對(duì)于適應(yīng)不良的激活作用已被證實(shí),在慢性腎臟病發(fā)病機(jī)制上起著關(guān)鍵作用。對(duì)于AngⅡ的許多非血流動(dòng)力學(xué)影響作用,活性氧簇(ROS)是一個(gè)關(guān)鍵的信號(hào)。研究已證實(shí),AngⅡ通過(guò)NADPH氧化酶增加了腎小球系膜和皮質(zhì)環(huán)氧合酶-2(COX-2)的表達(dá)和活性,轉(zhuǎn)錄因子Ets-1已被確定為一個(gè)生長(zhǎng)相關(guān)反應(yīng)和炎癥的調(diào)節(jié)因子[13]。

4 Ets家族的生理作用

在細(xì)胞、組織和器官水平,Ets家族作為轉(zhuǎn)錄因子參與多種哺乳動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程,包括細(xì)胞增殖、分化、遷移、凋亡和細(xì)胞間相互作用。在組織發(fā)育過(guò)程中,骨髓系統(tǒng)、淋巴組織、中樞神經(jīng)系統(tǒng)及乳腺組織中均可見(jiàn)到不同類型的Ets表達(dá)。在正常的血管形成過(guò)程中,上皮細(xì)胞可檢測(cè)到Ets-1、Erg-1和Fil-1的表達(dá),它們調(diào)控上皮特異的基因表達(dá),而后者對(duì)于新生血管的形成至關(guān)重要。骨的形成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程,包括成骨細(xì)胞的前體——間葉細(xì)胞分化成前成骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和成熟的成骨細(xì)胞,最終發(fā)生ECM的積累和骨化。在前成骨細(xì)胞中檢測(cè)到Ets-1表達(dá),而在分化成熟的成骨細(xì)胞中檢測(cè)到Ets-2的表達(dá)[14]。在所有細(xì)胞中,具有轉(zhuǎn)錄活性的Ets家族成員(如Erf、Net和Tel)受到有絲分裂信號(hào)的調(diào)控,可能參與細(xì)胞周期的循環(huán)。具有轉(zhuǎn)錄抑制活性的Ets家族成員可能在細(xì)胞外信號(hào)的引導(dǎo)下,對(duì)維持發(fā)育期間細(xì)胞增生和分化之間的平衡起關(guān)鍵作用。

5 轉(zhuǎn)錄因子Ets與腎臟ECM重塑

各種腎臟疾病均以ECM過(guò)度積聚為主要特征。因此,闡明ECM的代謝調(diào)節(jié)機(jī)制對(duì)有效防治慢性腎臟病的進(jìn)展至關(guān)重要。正常腎小球胞外基質(zhì)主要由各種類型的膠原蛋白、層粘連蛋白、纖維連接素及硫酸多糖組成,腎小管胞外基質(zhì)則主要為膠原Ⅲ、膠原Ⅳ及層粘連蛋白組成。病理狀態(tài)下,表型轉(zhuǎn)化的腎小管上皮細(xì)胞大量分泌膠原蛋白,而引起ECM過(guò)度沉積[15],這些成分合成與降解之間的不平衡與ECM積聚密切相關(guān),從而導(dǎo)致腎臟疾病進(jìn)展。

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物(TIMPs)是調(diào)控ECM代謝的重要酶系,MMPs-TIMPs系統(tǒng)平衡紊亂與腎小球硬化、腎小管間質(zhì)損傷及腎間質(zhì)纖維化形成相關(guān)聯(lián)。MMPs是鉛依賴性蛋白酶,根據(jù)特性不同分為5種類型:膠原酶(MMP-1、-8、-13、-18)、明膠酶(MMP-2、MMP-9)、間質(zhì)溶 解素(MMP-3、MMP-10)、膜型MMP(MMP-14、-15、-16、-17)和其它類型MMP(MMP-7、-11、-12、-19)[16]。膠原酶,譬如MMP-1具有降解膠原的能力,在各種腎臟疾病中的ECM重塑中起著重要作用。因此,MMP表達(dá)或是活性的改變將直接影響ECM的降解,最終導(dǎo)致腎小球瘢痕形成及腎間質(zhì)纖維化發(fā)生。

在形態(tài)發(fā)生過(guò)程中,Ets家族在脈管結(jié)構(gòu)和組織結(jié)構(gòu)中都有表達(dá),也包括腎臟。在腎臟方面,有關(guān)Ets家族地位和作用的研究正逐漸展開(kāi)。Honda等[17]利用凝膠電泳及Southern blot方法研究發(fā)現(xiàn),Ets家族某些因子通過(guò)結(jié)合EBSs位點(diǎn)對(duì)Tsc2基因起負(fù)調(diào)節(jié)作用而參與了腎透明細(xì)胞癌進(jìn)展過(guò)程。Ets-1蛋白在細(xì)胞周期G0期起著重要作用,因其在腫瘤侵襲過(guò)程中的基質(zhì)重塑作用而在腫瘤生物學(xué)研究中備受關(guān)注。研究表明,Ets-1是MMP-1、MMP-3、MMP-9、u-PA和整合素β3(integrinβ3)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,這些物質(zhì)可通過(guò)降解ECM及基底膜,使腫瘤細(xì)胞粘著性降低,并易于游走,有利于腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和腫瘤血管生成。Ets-1蛋白通過(guò)DNA連接區(qū)域結(jié)合中央GGA的核心序列(PEA3),在AP-1位點(diǎn)與c-Fos/c-Jun復(fù)合物相互作用,從而激活特定的啟動(dòng)因子表達(dá),表明Ets-1原癌基因在對(duì)基質(zhì)蛋白酶的調(diào)控中起著關(guān)鍵性作用[18]。Reisdorff等[19]研究轉(zhuǎn)錄因子Ets-1在系膜細(xì)胞中調(diào)節(jié)明膠酶A(MMP-2)的表達(dá)中,提及明膠酶A在系膜細(xì)胞激活表型轉(zhuǎn)化中的作用,明膠酶A通過(guò)Ets-1的基因轉(zhuǎn)錄反式激活在炎癥反應(yīng)中可能起著重要作用。我們?cè)诖笫笮略麦w性腎小球腎炎模型中,發(fā)現(xiàn)Ets-1在腎小球硬化及間質(zhì)纖維化進(jìn)程中與MMP-3關(guān)系密切,并指出通過(guò)Ets-1誘導(dǎo)的MMP-3蛋白表達(dá)上調(diào)可能在損傷腎組織中參與基質(zhì)重塑過(guò)程[20]。Naito等[21]在大鼠腎小管上皮細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn),Ets-1蛋白表達(dá)上調(diào)誘導(dǎo)了IL-1介導(dǎo)的MMP-9表達(dá)顯著增加,但未見(jiàn)IL-1介導(dǎo)的MMP-2、-3表達(dá)明顯增高。另外,與ECM降解及重塑有關(guān)的MMP-1、3、9在其他研究中也被證實(shí)同樣受Ets-1的調(diào)節(jié)。Puri等[22]發(fā)現(xiàn)在多囊腎疾病中,Fli-1能下調(diào)PKD1基因的表達(dá),而Ets-1則上調(diào)其表達(dá)。最近我們研究表明,Ets-1轉(zhuǎn)錄因子可能通過(guò)動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)MMP-1與TIMP-1酶系統(tǒng)的平衡,對(duì)膠原Ⅲ在腎間質(zhì)內(nèi)沉積產(chǎn)生影響,進(jìn)而參與順鉑相關(guān)性腎病ECM重塑過(guò)程[20]。

Ets-1基因敲除小鼠的腎臟呈現(xiàn)出腎小球發(fā)育不成熟、腎小球數(shù)量減少、腎小球硬化、腎小管萎縮及嚴(yán)重腎間質(zhì)纖維化形成,這可能說(shuō)明Ets-1蛋白過(guò)度表達(dá)對(duì)腎小球正常結(jié)構(gòu)破壞及間質(zhì)纖維化形成起著一定防護(hù)作用[23]。研究表明,Ets-1在腎小球系膜細(xì)胞培養(yǎng)中的表達(dá)上調(diào)可以有效阻止TGF-β誘導(dǎo)的膠原Ⅰ產(chǎn)生,Ets-1基因轉(zhuǎn)染的腎小球內(nèi)MMP-1、3、9 mRNA表達(dá)增加并伴有系膜ECM沉積、層粘連蛋白及膠原Ⅰ表達(dá)降低;而在Ets-1敲除的腎小球內(nèi)可見(jiàn)大量ECM沉積,因此得出Ets-1促使ECM降解而在維持腎小球結(jié)構(gòu)重塑中起著關(guān)鍵性作用[23]。報(bào)道還指出,泛醌能可逆性地通過(guò)與靶蛋白的賴氨酸殘基共價(jià)鍵結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)Ets-1轉(zhuǎn)錄因子的活性,但不清楚其對(duì)蛋白酶降解途徑是否有對(duì)抗性作用[24]。因此,有必要進(jìn)一步研究Ets-1原癌基因在各種類型腎小球腎炎進(jìn)程中的不同階段,是充當(dāng)疾病的進(jìn)展因素還是保護(hù)因素。

總之,轉(zhuǎn)錄因子Ets家族在腎臟ECM重塑調(diào)節(jié)中的作用備受關(guān)注。在腎臟疾病進(jìn)展的不同病理生理時(shí)期,通過(guò)合理調(diào)控Ets的表達(dá),在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)水平上調(diào)節(jié)MMPs/TIMMPs系統(tǒng)平衡,進(jìn)而影響腎臟ECM重塑,可有效防治早期腎損傷及晚期腎臟纖維化形成,為治療腎臟纖維化提供創(chuàng)新性治療靶點(diǎn)。

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