李曉東，徐東平，張玲霞

乙型肝炎病毒（HBV）的多聚酶或反轉(zhuǎn)錄酶缺乏3'→5'切割活性，不能校正反轉(zhuǎn)錄過程中錯誤摻入的堿基，出錯頻率達(dá)到約10-7堿基/天，由于病毒每天復(fù)制量達(dá)到1014堿基，因此其潛在的錯配堿基可達(dá)到107堿基/天，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于DNA病毒的平均水平[1-4]。HBV基因變異可引起病毒生物特性的改變，如產(chǎn)生對抗病毒藥物的耐藥、影響病毒復(fù)制速率、抗原表位變化等[5-8]。因此，分析研究HBV基因變異特性，對深入闡明乙型肝炎（乙肝）的發(fā)病機制、監(jiān)測病程發(fā)展、指導(dǎo)臨床合理進(jìn)行抗病毒治療以及研發(fā)新的抗HBV藥物具有重要意義。到目前為止，國際上已建立了4個HBV專業(yè)序列數(shù)據(jù)庫：HBVRegDB、HVDB、SeqHepB和HepSeq，總計收錄HBV A～H 8種基因型的全基因組序列2000余條，HBV基因片段序列1萬余條。下面對這4種數(shù)據(jù)庫的發(fā)展現(xiàn)狀進(jìn)行綜述。

1 HBV專業(yè)序列數(shù)據(jù)庫簡介

1.1 HBVRegDB 該數(shù)據(jù)庫由新西蘭Otago大學(xué)建立[9]，網(wǎng)址是http://lancelot.otago.ac.nz。該數(shù)據(jù)庫收錄的序列有20余條，包含了HBV及正嗜肝DNA病毒屬、鳥類嗜肝DNA病毒屬，并對其收錄的序列均進(jìn)行了詳盡的專業(yè)標(biāo)注，涵蓋了絕大多數(shù)目前實驗已經(jīng)證明了的功能分區(qū)，并都用Vector NTI軟件進(jìn)行了圖形化處理，這些序列均提供免費下載。

該數(shù)據(jù)庫擁有序列比對功能，使用者輸入待比對序列的核酸序列或者Entrez序列號，即可與庫中某條HBV序列進(jìn)行比對，由此得知待比對序列所處的功能區(qū)；也可以使用CDS-Plotcon組件，得到待比對序列的高度保守區(qū)，并用峰圖顯示出來（使用該功能需要內(nèi)部帳戶）。該數(shù)據(jù)庫還提供Alidot軟件下載，此軟件可以分析出RNA的二級結(jié)構(gòu)。使用者還可以通過網(wǎng)站的Transterm組件得到待比對序列的蛋白模序[10]。

1.2 HVDB 該數(shù)據(jù)庫是由日本名古屋市立大學(xué)建立的綜合性肝炎病毒序列數(shù)據(jù)庫[11]，網(wǎng)址是http://s2as02.genes.nig.ac.jp。該數(shù)據(jù)庫最大的特點是收錄的序列數(shù)量多，包含所有國際核酸序列數(shù)據(jù)庫合作組織收錄的HAV、HBV、HCV、HDV、HEV核酸序列及氨基酸序列，并隨時更新。其中HBV全基因組序列1163條，其他序列片段1萬余條。

網(wǎng)站建設(shè)者將所有序列都與參考序列進(jìn)行了比對，并得到進(jìn)化樹及基因距離矩陣。使用者可以通過圖形化界面查詢?nèi)我饩_位置的核酸或氨基酸序列，得到這段序列與該數(shù)據(jù)庫內(nèi)所有序列的詳細(xì)比對結(jié)果，并可免費下載所有進(jìn)化樹和矩陣；也可以通過網(wǎng)站提供的BLAST功能，提交任意片段的核酸或氨基酸序列，與數(shù)據(jù)庫中的序列比對。HVDB還提供了一些個性化的設(shè)置，使用者注冊得到帳戶后，可以在網(wǎng)站設(shè)置自己的私人分區(qū)，即選擇7個HBV開放讀碼框或全長序列作為自己私人關(guān)注的序列，或者自己上傳序列，并命名。在這個私人分區(qū)內(nèi)，使用者可以對私人關(guān)注的序列進(jìn)行比對及進(jìn)化樹分析。

1.3 SeqHepB 該數(shù)據(jù)庫是澳大利亞Evivar醫(yī)療公司開發(fā)的全球性突變數(shù)據(jù)庫[12]，網(wǎng)址是http://seqhepb.com/index.html。該數(shù)據(jù)庫可為臨床醫(yī)師治療HBV感染提供幫助，注冊用戶可以在線使用網(wǎng)站的程序，輸入臨床分離的HBV核苷酸和（或）氨基酸序列進(jìn)行比對分析。

SeqHepB能將輸入序列與相同基因型的參照序列相比對，從而定義所有的氨基酸變異，并通過數(shù)據(jù)庫內(nèi)置的結(jié)構(gòu)化查詢語言，將結(jié)果與HBV基因型、表型及臨床病史數(shù)據(jù)庫關(guān)聯(lián)。不同的數(shù)據(jù)采集算法和功能可以用來促進(jìn)耐藥性新標(biāo)記的快速有效鑒定。其另一項功能是在HBV聚合酶分子模型上定位氨基酸的改變，即檢測到的RT區(qū)變異能夠迅速定位到一個三維模型上，此模型可任意角度旋轉(zhuǎn)，并可以在酶催化區(qū)域與已知的抗病毒藥物結(jié)合。這一功能為研究突變在病毒耐藥中的可能意義及耐藥發(fā)生的可能機制提供幫助。綜合上述功能，病毒學(xué)家與臨床醫(yī)師可以為患者制定個性化治療措施，以應(yīng)對由HBV耐藥突變引起的病毒反彈，在治療期間開展回顧性或者前瞻性研究。目前，香港中文大學(xué)已經(jīng)與Evivar公司合作，成立了HBV管理中心，指導(dǎo)臨床醫(yī)師用藥。

1.4 HepSeq 該數(shù)據(jù)庫由英國健康保護(hù)機構(gòu)開發(fā)[13]，網(wǎng)址是http://www.hpa-bioinfodatabases.org.uk/hepatiis_open/main.php。HepSeq收集了大量HBV分子生物學(xué)、流行病學(xué)和臨床資料，有1000余例乙肝患者的資料和1000余條HBV序列，但這些資料不全部公開，只有獲得HepSeq授權(quán)的組織或個人才能查閱患者資料。

HepSeq內(nèi)置了功能強大的圖表制作軟件，使用者可以在性別、國籍、民族及表面抗原、表面抗體、基因型等流行病學(xué)因素中任選一項或二項，繪制成餅圖或復(fù)式條圖，以觀察某項因素的構(gòu)成比，或觀察二項之間的線性關(guān)系。HepSeq還提供了功能完善的序列分析軟件，通過SeqMatch組件可以在數(shù)據(jù)庫中查詢相似序列，結(jié)果以類似美國國立生物技術(shù)信息中心核酸比對的形式用列表展示出來?；蚍中凸ぞ摺狦enotyper組件可以幫助使用者鑒別所提交序列的基因型，其鑒定的依據(jù)是P區(qū)和S區(qū)的保守序列。突變分析工具——Mutation Annotator組件非常實用，它不僅具有基因分型功能，而且能通過與參考序列的比對，判別出變異位點，并分析這些位點是否包含已報道的耐藥相關(guān)位點。

此外，歐洲卓越網(wǎng)絡(luò)的病毒耐藥警戒數(shù)據(jù)庫ViRgil也試圖在原有流感病毒等病毒的基礎(chǔ)上，拓展建立一個包含HBV和HCV變異序列的大型數(shù)據(jù)庫[14]。

2 已有數(shù)據(jù)庫不足之處

現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫均存在不足之處。HBVRegDB數(shù)據(jù)庫收錄的序列數(shù)量太少，且沒有HBV序列樣本的臨床資料。HVDB數(shù)據(jù)庫不能提供耐藥位點分析，且收集的序列沒有相關(guān)的臨床資料，無法進(jìn)行臨床特征分析。SeqHepB數(shù)據(jù)庫雖功能強大，但目前不對公眾開放，使用該數(shù)據(jù)庫須要交納較昂貴的費用。HepSeq數(shù)據(jù)庫雖功能完善，但其收錄的序列以歐洲人群中流行的A型和D型為主，并且其臨床資料只對與其合作的科研組織開放。目前，所有已知HBV序列數(shù)據(jù)庫都不能提供基因克隆實物。

3 小 結(jié)

我國HBV的基因型以C型和B型為主。已證明HBV序列的一些突變與乙肝慢性化、重癥化密切相關(guān)。例如，HBV前C區(qū)和基本核心啟動子的突變可以終止e抗原產(chǎn)生或抑制HBeAg分泌，增加病毒復(fù)制能力，與乙肝遷延不愈和病情加重相關(guān)[15-24]；又如，前S2基因區(qū)的缺失突變可使HBV中蛋白合成障礙及大蛋白合成異常增加，后者大量沉積形成毛玻璃樣改變，加重了肝細(xì)胞損傷[25-28]。近年來，由于核苷（酸）類抗病毒藥物的廣泛使用，使藥物所針對的靶位——HBV多聚酶/反轉(zhuǎn)錄酶的突變頻率顯著增加，造成臨床抗病毒治療失敗[29-36]。

雖然近年來國內(nèi)對HBV序列變異及其臨床和生物學(xué)意義研究日益重視，但研究機構(gòu)間并未將序列資源有效地整合在一起形成共享平臺。因此，建立一個具有足夠代表性的中國人的HBV序列多功能數(shù)據(jù)庫是十分必要的，這個序列數(shù)據(jù)庫最好還能提供樣本的臨床資料及代表性HBV變異基因克隆實物。通過建立這樣的一個數(shù)據(jù)平臺，可以促使各個實驗室充分利用已有資源，進(jìn)行HBV感染的分子流行病學(xué)調(diào)查、HBV耐藥相關(guān)突變和其他突變分析、突變HBV復(fù)制表達(dá)細(xì)胞模型建立、抗HBV新藥體外藥物敏感性試驗、HBV抗原表位分析及HBV基因疫苗構(gòu)建等研究，推動我國的乙肝防治事業(yè)的發(fā)展。

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