李鳳蘭，李學(xué)湛，閔凡祥，韓 峰，魏 琪，馮艷忠，郭 梅*

（1．東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2．黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物脫毒苗木研究所，哈爾濱 150086；3．黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，哈爾濱 150010）

實(shí)時(shí)定量PCR（Real-time Quantitative PCR，RQ PCR）是一種在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上運(yùn)用熒光能量傳遞（Fluorescence Resonance Energy Transfer，F(xiàn)R-ET）技術(shù)，在反應(yīng)體系中添加熒光標(biāo)記探針，從而巧妙地將核酸擴(kuò)增與雜交、光譜分析和實(shí)時(shí)檢測技術(shù)結(jié)合在一起的檢測技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)無需常規(guī)PCR后的操作，同時(shí)還可以利用反應(yīng)過程中的熒光探針?biāo)l(fā)出的熒光的變化對擴(kuò)增過程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測[1]。因此，這種技術(shù)以其特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快、閉管操作無交叉污染，并可同時(shí)檢測同一樣品中的多種靶序列的優(yōu)點(diǎn)成為植物病理學(xué)研究中的重要方法之一[2]。在植物病原菌檢測研究中，實(shí)時(shí)PCR不僅在植物的病毒性病害[3-5]、線蟲病害[6-9]和細(xì)菌病害[10-13]的快速檢測中得到了充分的應(yīng)用，并且在植物真菌病害的檢測研究中也得到了快速發(fā)展。相對常規(guī)PCR而言，實(shí)時(shí)PCR具有顯著優(yōu)勢。這種技術(shù)避開了過度擴(kuò)增步驟，大大減少了實(shí)驗(yàn)時(shí)間和勞動力投入，從而增加了PCR實(shí)驗(yàn)的處理量，成為進(jìn)行大規(guī)模分析的自動化檢測系統(tǒng)。在定量PCR的鑒定過程中常采用兩種主要策略來檢測和鑒定真菌小種或菌株的專一性靶序列：①對保守基因進(jìn)行擴(kuò)增和測序，保守基因一般是對于所有的真菌都具有的基因，而引物采用通用引物；②采用非專一性隨機(jī)引物擴(kuò)增未知基因區(qū)域[14]。

1 植物真菌病原體定量PCR檢測方法及影響因素

在真菌基因組中，核編碼核糖體RNA基因（rDNA）是高度保守的，這為鑒定不同真菌小種提供了一個最佳的靶序列，可以采用通用引物對這些序列進(jìn)行擴(kuò)增和測序[15]。根據(jù)rDNA的保守區(qū)域設(shè)計(jì)的探針和引物可以對小種、家族，甚至界中相同的核糖體基因進(jìn)行鑒定[16]。在不同病原真菌中檢測到特異DNA片段序列還可以用于不同真菌小種的鑒定。在變化的區(qū)域中，ITS是真菌中最廣泛使用的鑒定序列[17-19]。本研究組在對馬鈴薯的鐮刀菌進(jìn)行定量檢測研究過程中，利用不同致病小種的ITS區(qū)域保守基因特異性序列設(shè)計(jì)了熒光探針，成功的對黑龍江省馬鈴薯干腐病的6個主要致病小種及變種進(jìn)行熒光定量檢測。結(jié)果表明，采用ITS區(qū)域設(shè)計(jì)引物可以有效的對不同的鐮刀菌小種進(jìn)行鑒定。

要對植物真菌的靶DNA進(jìn)行準(zhǔn)確、可靠和高流通量的定量就需要采用實(shí)時(shí)PCR的方法。特別是多重PCR（Multiplex PCR）的應(yīng)用大大提高了實(shí)時(shí)PCR對植物真菌病原體定性和核酸含量定量的檢測能力。這種技術(shù)就是在一個反應(yīng)管中同時(shí)加入多對不同PCR引物和相應(yīng)的模板，可在同一反應(yīng)管中同時(shí)擴(kuò)增出一條以上的目的基因，進(jìn)行同時(shí)檢測、鑒別出多種病原體，在臨床混合感染的鑒別診斷上有其獨(dú)特優(yōu)勢和很高的實(shí)用價(jià)值，并能大大提高精度節(jié)約成本[20]。這種方法可以同時(shí)對多個模板進(jìn)行鑒定，這種特性大大的推進(jìn)了實(shí)時(shí)PCR在植物真菌病害病原菌規(guī)?；瘷z測中的應(yīng)用潛力。Winton等采用標(biāo)有不同熒光基團(tuán)TaqMan探針同時(shí)檢測出花旗松（Douglas fir）和病原體Phaeocryptopus gaeumanii的DNA[21]；Ippolito等采用兩個不同蝎形引物在一個單管中同時(shí)鑒別了兩種根霉病原菌（Phytophthora nicotianae和Phytophthora citrophthora）[22]。此外，在常規(guī)PCR檢測操作過程中，反應(yīng)結(jié)果常受一些天然化合物，例如腐殖酸、鞣酸、木質(zhì)素混合物等抑制因素的影響，原因是這些抑制因素對PCR反應(yīng)過程中后期的循環(huán)（這些循環(huán)對后期產(chǎn)物積累是非常關(guān)鍵的）產(chǎn)生影響。但是在實(shí)時(shí)分析過程中，這些物質(zhì)的影響卻很小，因?yàn)閷?shí)時(shí)定量的試驗(yàn)結(jié)果并不依賴于PCR產(chǎn)物的積累，而是通過早期階段熒光信號的產(chǎn)生來實(shí)現(xiàn)的[23]。

在使用實(shí)時(shí)PCR方法對植物真菌病原體進(jìn)行定量分析時(shí)，還存在著一定的局限性，主要是這種方法不能對樣本中生活和死亡病原菌的核酸進(jìn)行鑒別，因此，在對天然樣本進(jìn)行定量分析時(shí)，可能會出現(xiàn)檢測結(jié)果不確定性[24]。有報(bào)道表明，在土壤中核酸會被DNA酶快速降解[25]。核酸酶廣泛的分布在環(huán)境中，并且在微生物死亡后可以將病原菌的DNA降解掉，但是微生物DNA的降解率在很大程度上依賴于環(huán)境條件。有研究發(fā)現(xiàn)褐座堅(jiān)殼菌（Rosellinia necatrix）的DNA在土壤中很快被降解，從而降低了檢測結(jié)果的假陽性可能性[18]，但是，也有研究表明，土壤中一些化合物可以使DNA在土壤中保持很長時(shí)間[26]。為了避免檢測到死細(xì)胞中DNA而出現(xiàn)假陽性的現(xiàn)象，現(xiàn)在發(fā)展起來一種將實(shí)時(shí)PCR與生物學(xué)相結(jié)合的技術(shù)，即BIO-PCR技術(shù)[27]。它不僅增加微生物的生物學(xué)擴(kuò)增的檢測敏感度，同時(shí)又可以避免從復(fù)雜環(huán)境樣本（如土壤）中提取DNA的問題。這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)對存在于自然土壤中絲核菌（Rhizoctonia solani）[17]和根霉病原菌（Phytophthora nicotianae）[28]進(jìn)行檢測，并取得了較好的效果。

2 土壤棲息的植物真菌病原體定量檢測

由于實(shí)時(shí)PCR的可實(shí)時(shí)檢測性，這項(xiàng)技術(shù)也被應(yīng)用在土壤中真菌病原菌DNA的檢測中。Landeweert等從含有多種微生物土壤樣品檢測出兩種外生菌根真菌（Suillus bovinus和Paxillus involutus），并且在研究中發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間的發(fā)展S.bovinusDNA的量增加，而P.involutusDNA的量減少[29]。陶萌等采用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)對土壤中粉紅粘帚霉高效生防菌株6721進(jìn)行了定量檢測，結(jié)果表明，所建立的PCR檢測方法靈敏度高、快速實(shí)用，相對于以稀釋涂板法為代表的傳統(tǒng)方法省時(shí)、省力、準(zhǔn)確性高，而且適合生態(tài)學(xué)研究的要求[30]。另外，實(shí)時(shí)PCR技術(shù)也被應(yīng)用在土壤中茄長蠕孢（Helminthosporium solani）[31]，炭疽菌（Colletotrichum coccodes）[32]， 粉 痂 菌（Spongospora subterranea）[33]，腐皮鐮孢菌（Fusarium solanif.sp.Phaseoli）和灌木菌根真菌[34]、褐座堅(jiān)殼菌（Rosellinia necatrix）[18]、疫霉病菌（Phytophthora nicotianae和Phytophthora citrophthora）[22]等真菌 DNA 檢測中。

Ippolito等在對土壤中的Phytophthora nicotianae進(jìn)行定量分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，病原體在選擇性培養(yǎng)基（繁殖體/每克土壤）上的接種密度和Ct值之間存在強(qiáng)關(guān)聯(lián)性[28]。因此，實(shí)時(shí)PCR可以檢測土壤菌量閾水平范圍，這種菌量閾水平可以預(yù)測病原菌在土壤中的潛在發(fā)展趨勢，因此，可以利用這項(xiàng)技術(shù)進(jìn)行預(yù)測性的診斷試驗(yàn)，如果某塊田地土壤中病原菌的菌量超過了閾值，就可以確定其為高發(fā)病的田地，因此，對土壤中病原菌進(jìn)行定量分析顯得極其重要。另外，在進(jìn)行殺菌劑劑量選擇時(shí)，可以將土壤中的真菌繁殖體的閾水平作為依據(jù)。例如在柑橘類植物中，如果對于根莖而言，疫霉的數(shù)量高于15～20個繁殖體·g-1土（ppg）時(shí)確定為易感的，并且高于30 ppg時(shí)確定為有抗性的，在這種標(biāo)準(zhǔn)下確定殺菌劑的施用方案也更為經(jīng)濟(jì)合理[35]。

3 實(shí)時(shí)定量PCR對寄主組織中真菌D N A的定量檢測

對寄主組織中植物病原體的寄生率進(jìn)行定量和評估也是實(shí)時(shí)PCR一個非常有價(jià)值的應(yīng)用。據(jù)報(bào)道，研究者已經(jīng)成功對馬鈴薯中的茄長蠕孢（Helminthosporium solani）、炭疽菌（Colletotrichum coccodes）和 VA 菌根真菌（Glomus mosseae），具有廣泛寄主的晚疫病菌（Phytophthora infestans）和柑桔褐腐疫霉（Phytophthora.Citrophthora）[36]，大豆種子中的潰瘍病菌（Diaporthe phaseolorum和Phomopsis longicolla）[37]，不同寄主根和樹皮中的褐座堅(jiān)殼菌（Rosellinia necatrix）[18]，柑桔根中的疫霉病菌（Phytophthora nicotianae和Phytophthora.citrophthora）[22]，被感染的大麥種子上的網(wǎng)斑病菌（Pyrenophora teres）[38-39]，玉米，胡椒和辣椒上的黃曲霉菌（Aspergillus flavus）[40]等真病原菌進(jìn)行了有效的定量分析。Winton等利用兩個標(biāo)有不同熒光集團(tuán)的探針，同時(shí)對寄主花旗松（Douglas fir）和病原菌（Phaeocryptopus gaeumannii）DNA 進(jìn)行定量[21]。在這個試驗(yàn)中，寄主DNA被當(dāng)作定量檢測的一個內(nèi)參，這個內(nèi)參可以作為一個內(nèi)在的陽性對照，這種內(nèi)參可以修正由于DNA提取和PCR過程中樣品不同帶來的差異，同時(shí)，他們又將實(shí)時(shí)PCR檢測的方法同子實(shí)體豐度法（Fruiting Body Abundance）、麥角固醇含量法（Ergosterol Content）和免疫印跡法（Dot Blot Analysis）等方法進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)TaqMan實(shí)時(shí)PCR對冷杉（Douglasfir needles）體內(nèi)的真菌相對增長量的計(jì)算更準(zhǔn)確[41]。胡浩等利用常規(guī)PCR和TaqMan探針法、SYBRGreenI熒光染料法兩種熒光定量PCR兩種方法對柑桔體內(nèi)的黃龍病病菌的變化動態(tài)進(jìn)行檢測，結(jié)果表明熒光定量PCR方法的靈敏度比常規(guī)PCR高出至少2～3個數(shù)量級，確定TaqMan探針法更適合于柑桔黃龍病的檢測[42]。

由于高靈敏性和重復(fù)性，實(shí)時(shí)PCR也是檢測寄主抗性和易感性微小變化的理想方法。Qi等采用實(shí)時(shí)PCR的方法準(zhǔn)確評估水稻的稻瘟病抵抗水平，結(jié)果表明，在葉片出現(xiàn)損傷時(shí)，在易感染的植株中稻瘟病病菌的增長比抗性品種高80倍[43]。Hietala等在挪威云杉（Picea abies）上接種了異擔(dān)孔菌（Heterobasidion annosum），結(jié)果表明，在具有高度抗性的植物體上真菌DNA是非常有限的，并且只局限于侵害部位，而在低抗性的植物體上，在出現(xiàn)損害癥狀之前，真菌DNA已經(jīng)可以被檢測到[44]。

4 結(jié)語

隨著實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)的快速發(fā)展和大量實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)的積累，特別是這項(xiàng)技術(shù)所表現(xiàn)出來的敏感性、快速性和通用性，推動了它在植物真菌研究中快速和廣泛發(fā)展的進(jìn)程。實(shí)時(shí)PCR可以精確的對一些植物真菌病害特性進(jìn)行研究，相對于常規(guī)PCR而言，實(shí)時(shí)定量PCR分析可以獲得一些重要的關(guān)鍵性信息，對于研究寄主-病原菌之間互作機(jī)制、病原菌同環(huán)境互作機(jī)制和mRNA的定量等過程中表現(xiàn)出了其他檢測技術(shù)無法比擬的優(yōu)勢。雖然，相對常規(guī)PCR，應(yīng)用在實(shí)時(shí)PCR中的引物和熒光探針的數(shù)量是有限的，但是，在將來會有越來越多的引物和探針被發(fā)展起來，特別是隨著人們對真菌基因組認(rèn)識的增加，傳統(tǒng)PCR診斷技術(shù)不斷的完善，這些研究基礎(chǔ)為實(shí)時(shí)PCR檢測快速發(fā)展提供了強(qiáng)有力的保障。因此，在檢測的常規(guī)服務(wù)中實(shí)時(shí)PCR必將成為大規(guī)模診斷植物病害致病真菌的標(biāo)準(zhǔn)方法。

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