張士芳

（1.東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物資源學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江省科學(xué)院自然與生態(tài)研究所 150040）

人及哺乳動(dòng)物的精子在離開(kāi)生殖道時(shí)，還不能立即與卵子受精，它必須經(jīng)歷一系列生理、生化及形態(tài)的變化才能獲得受精能力，這種生理現(xiàn)象稱(chēng)之為獲能（capacitation）[1]。精子獲能是精子受精前必須經(jīng)歷的一個(gè)生理階段。自然情況下，精子獲能是在雌性生殖道內(nèi)進(jìn)行，自宮頸開(kāi)始，經(jīng)歷子宮和輸卵管，最后完成于輸卵管壺腹部[2]。研究表明，精子獲能不僅可以在雌性動(dòng)物生殖道內(nèi)進(jìn)行，也可以在體外適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下進(jìn)行。

1 精子獲能的方法

精子獲能的方法分為體內(nèi)獲能和體外獲能兩種。

1.1 體內(nèi)獲能

早期的獲能研究，采用體內(nèi)獲能的方法，即從交配母畜的子宮內(nèi)取出精子用于受精，以受精率為指標(biāo)，分析獲能的部位、時(shí)程及其機(jī)制[3]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，獲能過(guò)程沒(méi)有種的特異性，即精子不僅在同種生殖道內(nèi)，而且可以在異種動(dòng)物生殖道內(nèi)或液體內(nèi)進(jìn)行獲能。將牛精子放入家兔子宮和豬輸卵管內(nèi)培養(yǎng)同樣能使精子獲能[4]。精子在成熟過(guò)程中，表面被覆了蛋白質(zhì)類(lèi)和多胺類(lèi)，這些物質(zhì)的存在對(duì)獲能具有抑制作用。在體內(nèi)獲能期間，精子在雌性生殖道內(nèi)運(yùn)動(dòng)時(shí)，子宮頸黏液、輸卵管液和卵泡液，以及輸卵管上皮細(xì)胞等，都有助于清除精子表面的抑制因子，促進(jìn)獲能的發(fā)生。由于體內(nèi)獲能的研究，經(jīng)常受到許多條件的限制，在機(jī)體生殖道內(nèi)培養(yǎng)需時(shí)間，其環(huán)境也受卵巢激素影響，不穩(wěn)定因素多，且雌性生殖道內(nèi)，特別是輸卵管內(nèi)回收到的精子數(shù)量太少，測(cè)定獲能精子化學(xué)成分的改變更加困難；并且，精子在體內(nèi)總是與雌性生殖道分泌物接觸，而雌性生殖道中存在著影響獲能的因子，對(duì)于復(fù)雜的體內(nèi)環(huán)境人們又很難控制，因而給研究精子獲能帶來(lái)極大的困難。為此，體外獲能的研究方法應(yīng)運(yùn)而生[3]。

1.2 體外獲能

早期研究精子體外獲能通常使用各種動(dòng)物的體液（如輸卵管液、濾泡液和血清等），而這些體液的成分相對(duì)復(fù)雜，很難確定何種成分誘發(fā)或支持精子獲能。自從Toyoda等最先報(bào)道了采用一種特定的化學(xué)培養(yǎng)基獲得體外受精成功以來(lái)，分析體外精子獲能已成為比較容易的事情[5]。以Tyrode、KRB、HamF10、BSA、BWW、BO等培養(yǎng)液進(jìn)行哺乳動(dòng)物精子獲能培養(yǎng)均見(jiàn)報(bào)道。目前，常用的為BO液和改良的Tyrdoe液（TALP）兩大類(lèi)。許多哺乳動(dòng)物，如鼠、牛、猴、馬等，其精子體外獲能的研究越來(lái)越多。近年來(lái)的研究表明，體外獲能發(fā)展起來(lái)的實(shí)驗(yàn)手段幾乎可以達(dá)到與體內(nèi)獲能相同的效果，這就使得體外獲能的研究可以揭示體內(nèi)獲能的本質(zhì)[6]。精子體外獲能技術(shù)可以較好地控制實(shí)驗(yàn)條件，并可逐個(gè)分析獲能的相關(guān)因子，極大地促進(jìn)了精子獲能的研究。

精子體外獲能總體包括兩個(gè)步驟：一是精液的處理，目的是減少或去除精漿內(nèi)前列腺素、免疫活性細(xì)胞、細(xì)菌和碎片，減少精液的黏稠度，以促進(jìn)精子獲能；二是使用某些特定成分誘導(dǎo)精子獲能和頂體反應(yīng)[3]。目前，誘導(dǎo)精子體外獲能的方法主要有上浮法、沉淀加上游法和不連續(xù)密度梯度法。

經(jīng)上浮法處理可獲得活力較強(qiáng)的精子，但精子回收率較低，目前該方法已成為牛精子（尤其是凍精）洗滌與體外獲能的主要方法；精子沉淀加上游法適用于精子活力尚可或含有大量白細(xì)胞及碎片的精液，此方法有利于分離活動(dòng)精子與死精子，且回收率較高；不連續(xù)密度梯度法是近年用于分離精子的良好方法，密度梯度離心法原理是形態(tài)正常精子的密度要高于異常的精子，經(jīng)平衡離心后得到高受精力的正常精子，該法適用于精子數(shù)量正常而活力較差的精液。若與精子上浮技術(shù)相結(jié)合，不連續(xù)密度梯度法可獲得更高質(zhì)量的精子[6]。

精子的質(zhì)量不同，獲能所使用的處理方法也不同，要根據(jù)精子的來(lái)源及質(zhì)量選擇相應(yīng)的處理方法。江峰根據(jù)所使用人精液的質(zhì)量，將其處理方法分為7種：（l）少精子癥，離心后再重懸于較小體積營(yíng)養(yǎng)液中；（2）弱精子癥，離心-上游技術(shù)結(jié)合添加咖啡因或血管舒緩素；（3）畸形精子，牛血清白蛋白（BSA）、人血清白蛋白或牛宮頸黏液濾過(guò)、Percoll密度梯度離心；（4）液化不全，玻璃纖維過(guò)濾；（5）黏度過(guò)高，淀粉酶處理、密度梯度離心等；（6）雜質(zhì)過(guò)多，上游法和Percoll密度梯度離心；（7）逆行射精，洗滌加上游處理[7]。

2 獲能評(píng)價(jià)的方法

精子獲能是一系列的生理生化反應(yīng)過(guò)程，其步驟分為：（1）超激活運(yùn)動(dòng) （hyperactivated motility，HAM）：精子鞭毛運(yùn)動(dòng)的頻率及類(lèi)型發(fā)生改變；（2）獲能：精子膜結(jié)構(gòu)及特征的精細(xì)改變；（3）頂體反應(yīng)（Arcosomal reaction，AR）：標(biāo)志著精子獲能已經(jīng)完成。根據(jù)獲能精子在運(yùn)動(dòng)、形態(tài)及代謝等方面的變化特征，創(chuàng)立了多種精子獲能的評(píng)價(jià)方法。目前，常用的精子獲能評(píng)價(jià)方法為精子超激活運(yùn)動(dòng)、頂體反應(yīng)和精子穿卵試驗(yàn)（sperm penetration test，SPA）。此外還有去能因子鑒定法、測(cè)定精子呼吸能等方法。

2.1 超激活運(yùn)動(dòng)

精子一旦獲能，其運(yùn)動(dòng)類(lèi)型即發(fā)生顯著改變，精子頭部側(cè)擺幅度和頻率明顯增加，尾部振幅加大，頻率加快，呈現(xiàn)一種特殊的超激活運(yùn)動(dòng)或鞭打樣運(yùn)動(dòng)。它是精子為適應(yīng)受精而形成的一種特殊的運(yùn)動(dòng)類(lèi)型，所反映的是精子運(yùn)動(dòng)能力和方式的改變。其特點(diǎn)是頭部運(yùn)行軌跡呈不規(guī)律的“8”字形，并顯著地偏離直線。精子的超激活運(yùn)動(dòng)一般存在兩種運(yùn)動(dòng)類(lèi)型：急劇地前向運(yùn)動(dòng)（或穿梭運(yùn)動(dòng)）和鞭打樣運(yùn)動(dòng)[3]。Yanagimachi于1970年首先在倉(cāng)鼠精子獲能時(shí)觀察到這種現(xiàn)象。Wang等報(bào)道，人精子超激活運(yùn)動(dòng)的發(fā)生率與體外受精率呈高度相關(guān)性，并且對(duì)于精子穿越輸卵管峽部，克服輸卵管上皮細(xì)胞的阻力，最后穿過(guò)卵丘細(xì)胞及其細(xì)胞外基質(zhì)和透明帶起著重要的作用[8]。

目前，觀察精子超激活運(yùn)動(dòng)的應(yīng)用技術(shù)有：顯微錄像技術(shù)、連續(xù)分步曝光技術(shù)和計(jì)算機(jī)輔助精子分析（CASA）技術(shù)等。CASA分析系統(tǒng)在臨床研究時(shí)備受青睞，它可達(dá)到客觀準(zhǔn)確地量化精子運(yùn)動(dòng)情況，通過(guò)對(duì)精子頭部運(yùn)動(dòng)軌跡擺動(dòng)圖形的分析，可獲得精子運(yùn)動(dòng)的多項(xiàng)參數(shù)，使人們對(duì)精子運(yùn)動(dòng)有更深層次的了解[9]。

2.2 頂體反應(yīng)

頂體反應(yīng)是精子在獲能過(guò)程中的生理變化和形態(tài)學(xué)變化，是哺乳動(dòng)物的精子具備受精能力的必要條件。早期的研究者認(rèn)為，頂體反應(yīng)是由精子質(zhì)膜和頂體外膜相互融合，形成囊泡化，使頂體內(nèi)含物逸出頂體。陳大元等認(rèn)為質(zhì)膜并不參與頂體囊泡化，而是雙層頂體外膜多位點(diǎn)自我融合而成[10]。雖然頂體反應(yīng)是獲能的終點(diǎn)，但獲能過(guò)程本身還存在著不同階段，需要采用相應(yīng)的判斷指標(biāo)。隨著細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)和免疫學(xué)以及顯微鏡技術(shù)的發(fā)展，許多檢測(cè)精子頂體反應(yīng)的技術(shù)相繼建立，如普通光鏡中的三色染色法（TST）和考馬斯亮藍(lán)染色法（CBB），電子顯微鏡檢查法（TEM）、熒光顯微技術(shù)中的金霉素?zé)晒馊旧ǎ–hlortetracycline，CTC）、Hoechst33258 結(jié)合的植物凝集素標(biāo)記法、頂體酶釋放測(cè)定法、單克隆抗體間接免疫熒光法和豌豆凝集素（FITC-PSA）標(biāo)記法等[11]。

近年來(lái)，金霉素?zé)晒馊旧夹g(shù)越來(lái)越受到人們的重視，它是根據(jù)精子不同獲能狀態(tài)進(jìn)行染色，并可將精子分為3種CTC熒光染色類(lèi)型，即F、B和AR型?！癋”型為未獲能精子，其頂體帽完整，整個(gè)頂體布滿黃綠色熒光；“B”型精子為已獲能精子，其特點(diǎn)是頂體帽仍然存在，但在頂體后區(qū)出現(xiàn)一條暗淡的熒光區(qū)帶；“AR”型精子，頂體帽缺，如整個(gè)精子頭部顯示淡綠色或無(wú)熒光，即為完成頂體反應(yīng)的精子。目前此法已廣泛應(yīng)用在小鼠、牛、豬、猴和狗等哺乳動(dòng)物和人頂體反應(yīng)機(jī)理研究中。并且Hewitt等將金霉素與活體熒光染料H33258對(duì)活精子進(jìn)行雙色染色用于觀察整個(gè)體外受精獲能和頂體反應(yīng)過(guò)程中頂體的變化[12]。

2.3 精子穿卵試驗(yàn)

精子穿卵實(shí)驗(yàn)是臨床上應(yīng)用最廣泛的評(píng)價(jià)精子受精能力的重要方法。它不僅可提供精子獲能和頂體反應(yīng)的狀況，而且還可以了解精子與卵膜的融合和精核的解聚能力。精子穿卵試驗(yàn)最早由Yanagimachi等報(bào)道[13]，后經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)化、改良，并進(jìn)一步標(biāo)準(zhǔn)化，使之適合于臨床應(yīng)用[14，15]。穿卵試驗(yàn)分為異種穿卵試驗(yàn)和同種穿卵試驗(yàn)。異種穿卵試驗(yàn)主要利用倉(cāng)鼠卵子和金黃地鼠卵子進(jìn)行精子獲能鑒定。倉(cāng)鼠卵異種精子體外穿透試驗(yàn)，通過(guò)檢測(cè)經(jīng)各種方法處理后的復(fù)蘇凍精或鮮精精子的穿卵率，來(lái)評(píng)價(jià)精子的受精能力和體外獲能效果。而去除透明帶的金黃地鼠卵子對(duì)獲能精子沒(méi)有種間特異性，即能夠接受同種或異種動(dòng)物獲能精子的穿入。將去除透明帶的金黃地鼠卵子與經(jīng)過(guò)獲能處理的精子一起孵育一段時(shí)間后，以有膨大的精子頭部或有雌雄原核并有精子尾部判斷為獲能精子穿入[15]。它為篩選避孕藥物和評(píng)價(jià)避孕藥物的效果及作用提供了新的方法。精子異種穿卵法在人、鼠、牛等動(dòng)物精子受精能力的檢測(cè)中均取得了比較好的效果[16]。

2.4 其他方法

去能因子鑒定法和測(cè)定精子呼吸能法也是精子獲能的鑒定方法。

去能因子鑒定法是用T-HCl（Tetracycline）標(biāo)記去能因子，獲能處理后，在顯微鏡下觀察，如果沒(méi)有熒光說(shuō)明精子表面的去能因子已被除去，精子可能已獲能；如果還可以看見(jiàn)熒光，則精子還沒(méi)有獲能。由于熒光的易淬滅性，使得這一方法并不可靠。

測(cè)定精子呼吸能法所依據(jù)的原理是獲能精子比新鮮精子代謝能量要大。但是由于其操作繁瑣，結(jié)果不穩(wěn)定，可信度不高，應(yīng)用較少。

3 結(jié)語(yǔ)

精子獲能是受精的重要因素。自精子獲能被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，對(duì)精子獲能的研究特別是體外獲能、獲能的評(píng)價(jià)等已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展。對(duì)精子獲能的變化，包括精子質(zhì)膜結(jié)構(gòu)與生物化學(xué)特性發(fā)生系列改變，質(zhì)膜膽固醇含量減少，膜的離子滲透性增加，膜的超極化，胞內(nèi)pH升高，Ca2+和cAMP含量增加，超氧陰離子生成量增多，以及特異蛋白質(zhì)的酪氨酸磷酸化增強(qiáng)等現(xiàn)象進(jìn)行了研究。而由于精子獲能的分子機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，且受到多種細(xì)胞信號(hào)途徑的調(diào)控，目前尚未明確，有待進(jìn)一步研究。

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