王 寧

(沈陽(yáng)師范大學(xué),遼寧,沈陽(yáng),110034)

1 海藻糖合酶的作用機(jī)制

由于尚未得到海藻糖合酶的蛋白晶體結(jié)構(gòu),目前對(duì)海藻糖合酶作用機(jī)制的研究?jī)H僅局限于理論推測(cè)階段。日本的科學(xué)家首先證明了海藻糖合酶的催化反應(yīng)是分子內(nèi)的重排過(guò)程,而不是分子之間的反應(yīng)。他們利用麥芽糖作為底物,并同時(shí)在反應(yīng)體系中加入 14C標(biāo)記的葡萄糖,試驗(yàn)結(jié)果顯示,并沒(méi)有具有放射性的海藻糖或麥芽糖的生成。隨后,韓國(guó)的科學(xué)家通過(guò)電噴霧質(zhì)譜法進(jìn)一步證明了這點(diǎn)。據(jù)報(bào)道,海藻糖合酶氨基酸序列的比對(duì)分析發(fā)現(xiàn),海藻糖合酶具有α-淀粉酶家族酶類所具有的四個(gè)保守區(qū):分別是 I XDXXXNH,II GXRXDXXZZ,IIIXXX(G/A)EZZZ, IV XXBBHD(X為疏水性氨基酸殘基,B為親水性氨基酸殘基,Z為影響酶反應(yīng)特異性的氨基酸殘基)。據(jù)此推測(cè),海藻糖合酶是α-淀粉酶家族成員之一。屬于α-淀粉酶家族的酶類具有相似的催化機(jī)制,在 II區(qū)和 III區(qū)中存在酶催化反應(yīng)的活性中心:III區(qū)中的 Glu為質(zhì)子供體,將一個(gè)質(zhì)子傳遞給底物 1,4-糖苷鍵中的 O原子;II區(qū)的 Asp為親核試劑,攻擊底物糖分子中的異頭中心碳原子,使 C1-O鍵斷裂。而 I區(qū)和 IV區(qū)中的 His介導(dǎo)底物和酶分子的結(jié)合根據(jù)α-淀粉酶家族酶類的催化機(jī)制,研究人員推測(cè)海藻糖合酶通過(guò)催化兩次取代反應(yīng)完成麥芽糖和海藻糖的相互轉(zhuǎn)變過(guò)程。首先,麥芽糖分子與酶的催化部位相結(jié)合,酶活性中心的 Glu將一個(gè)質(zhì)子傳遞給1,4-糖苷鍵中的 O原子,與此同時(shí) Asp攻擊 C1-O-C4中的 C1原子,形成鹽離子的過(guò)渡態(tài)。從而發(fā)生第一次取代反應(yīng),使麥芽糖分子中 C1-O鍵的斷裂,產(chǎn)生β-葡糖基 -酶的中間體。在此之后,酶的構(gòu)象會(huì)發(fā)生變化,使得另一個(gè)游離的葡萄糖分子的相對(duì)位置發(fā)生改變,其 C1-OH正好能夠親核攻擊葡萄糖基 -酶中間體上的 C1原子,發(fā)生第二次取代反應(yīng),產(chǎn)生α,α-1,1-海藻糖。某些海藻糖合酶,將麥芽糖轉(zhuǎn)化為α,α-海藻糖的同時(shí)還會(huì)有少量的α,β-海藻糖(約 3%)生成,這說(shuō)明在β-葡糖基 -酶的中間體形成后,酶分子可以改變?yōu)榱硪环N構(gòu)象,使得游離的葡萄糖分子在酶活中心內(nèi)部以另一種空間位置發(fā)生第二次取代反應(yīng)。如果水分子進(jìn)入酶活中心,并作為親核試劑優(yōu)先攻擊β-葡糖基 -酶的中間體上的碳原子,則會(huì)形成副產(chǎn)物葡萄糖,即發(fā)生雙糖的水解。通過(guò)定點(diǎn)突變的方法將紅色亞棲熱菌的海藻糖合酶分子中的催化位點(diǎn) Glu和 Asp突變?yōu)楸彼?結(jié)果顯示突變酶幾乎沒(méi)有活性,證明了這些位點(diǎn)對(duì)酶活的重要性。海藻糖合酶催化麥芽糖和海藻糖相互轉(zhuǎn)化的可逆反應(yīng),麥芽糖和海藻糖都可以作為海藻糖合酶的底物。

2 嗜熱菌海藻糖合酶的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

嗜熱菌的海藻糖合酶具有較高的最適反應(yīng)溫度和很強(qiáng)的熱穩(wěn)定性,其蛋白的分子量也較其他細(xì)菌中的海藻糖合酶大很多,嗜熱菌的海藻糖合酶比其他海藻糖合酶具有一個(gè)多余的 C端結(jié)構(gòu)域?？茖W(xué)家也通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明了這種 C端結(jié)構(gòu)域能夠增加海藻糖合酶的熱穩(wěn)定性,并降低反應(yīng)中副產(chǎn)物葡萄糖的生成。通過(guò)對(duì)嗜熱棲熱菌海藻糖合酶的 C端結(jié)構(gòu)域缺失體酶活性質(zhì)的研究,發(fā)現(xiàn) C端結(jié)構(gòu)域的缺失不會(huì)影響酶的活性,但是酶的最適溫度和熱穩(wěn)定性都有所降低。而將耐放射異球菌的海藻糖合酶與該 C端結(jié)構(gòu)域的融合表達(dá)后,酶的最適溫度和穩(wěn)定性都被顯著提高了。此外,C端結(jié)構(gòu)域可以使酶的構(gòu)象發(fā)生一定程度的變化,產(chǎn)生更為牢固緊密的構(gòu)象,使得水分子難以進(jìn)入活性中心,從而降低了副產(chǎn)物葡萄糖的生成。

3 海藻糖合酶在生物體內(nèi)起到的作用

通過(guò)對(duì)已經(jīng)純化或異源表達(dá)的海藻糖合酶特性的研究,發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞體外海藻糖合酶的可逆反應(yīng)是向著有利于生成海藻糖的方向進(jìn)行的,那么細(xì)胞體內(nèi)的情況是否也如此呢?隨著對(duì)海藻糖合成途徑研究的深入,發(fā)現(xiàn)某些細(xì)菌體內(nèi)具有兩條或 3條海藻糖合成途徑。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在高滲、超氧和酸性等外界環(huán)境壓力下,TPS和 TPP蛋白的合成水平明顯提高,而 TreS蛋白的合成量沒(méi)有變化或略有降低。這說(shuō)明在外界壓力下,海藻糖主要是由 TPS/TPP途徑合成,而 TreS的作用是將細(xì)胞內(nèi)積累的大量的海藻糖轉(zhuǎn)化為麥芽糖。在麥芽糖葡糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下,麥芽糖被合成為麥芽寡糖基多糖,并釋放出葡萄糖。葡萄糖被磷酸化后進(jìn)入糖酵解途徑。研究結(jié)果說(shuō)明大量的海藻糖對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)有一定的毒性作用,因此海藻糖的分解代謝對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)具有非常重要的作用

4 結(jié)語(yǔ)

雖然尚未得到海藻糖合酶的蛋白晶體結(jié)構(gòu),對(duì)其催化機(jī)制的研究只限于理論推測(cè)水平?？墒请S著蛋白結(jié)晶技術(shù)的發(fā)展,相信在不久的將來(lái)我們會(huì)得到海藻糖合酶的蛋白晶體結(jié)構(gòu),并對(duì)其催化機(jī)制作出更深入的解釋。海藻糖合酶已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于海藻糖的工業(yè)生產(chǎn),并大大降低了海藻糖生產(chǎn)的成本,但如何進(jìn)一步提高海藻糖合酶的酶活力和轉(zhuǎn)化率仍然是目前研究的熱點(diǎn)。利用生物信息學(xué)的知識(shí),通過(guò)飽和突變或定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)海藻糖合酶基因進(jìn)行遺傳學(xué)改造,改變酶活性中心附近以及與熱穩(wěn)定性相關(guān)的氨基酸序列,極有可能獲得酶活更高和穩(wěn)定性更高的海藻糖合酶。

[1]韋宇拓,黃日波,蒙健宗,等.谷氨酸棒桿菌海藻糖合成酶基因及海藻糖制造方法.中國(guó):200410013006.9.2005.

[2]韋宇拓,黃日波,蒙健宗,等.耐放射性異常球菌海藻糖合成酶基因及海藻糖制造方法.中國(guó):200410013008.8.2005.