生物柴油是指動植物油脂、餐飲廢油等與低碳醇反應(yīng)所得的脂肪酸甲酯(或乙酯)。近年來，由于石油價格持續(xù)飚升和生物柴油的環(huán)境友好性，生物柴油的價值日益凸顯。制備生物柴油的方法可以歸為四類：物理法、化學(xué)法、生物酶法以及超臨界法。作者在此簡要概述了國內(nèi)外生物柴油生產(chǎn)技術(shù)的優(yōu)缺點及其研究進展。

1 物理法

物理法是指通過物理機械的作用，將動植物油脂與石化柴油按比例混合，得到的油品因摻入了一定的動植物油脂而被稱為生物柴油。根據(jù)混合方式的不同，物理法分為直接使用法、稀釋混合法和微乳化法三種。

1.1 直接使用法

直接使用法迄今已有100多年的歷史，柴油機的發(fā)明者Rudolph Diesel當(dāng)初就是用花生油為燃料做測試的[1]。1981年，Bartholomew提出了用食物作燃料的概念，并且指出植物油和酒精必將取代石油，可再生能源一定會取代不可再生能源。植物油具有來源廣泛、可再生、對環(huán)境友好、運輸安全、熱值高等諸多優(yōu)點[2]，但用作燃料時存在粘度高、揮發(fā)性低以及不飽和脂肪酸的反應(yīng)活性差等缺點，特別是植物油的高粘度限制其不能在發(fā)動機中長期使用，因此，要改善植物油的性能，必須降低植物油的粘度，可以通過與碳氫化合物稀釋混合、微乳化作用、高溫分解(熱裂解)和轉(zhuǎn)酯反應(yīng)等[3]幾種途徑來實現(xiàn)。

1.2 稀釋混合法

1983年，Adams等[4]將脫膠大豆油和2#柴油以1∶1及1∶2混合，測試發(fā)現(xiàn),1∶1的混合油出現(xiàn)潤滑油層增厚和潛在的凝膠化作用，而1∶2的混合油適合用作農(nóng)業(yè)機械設(shè)備的燃料。1986年，Ziejewski等[5]將25%的葵花油和75%柴油混合作為燃料，這種混合油的粘度在40℃為4.88 cSt，高于美國材料試驗學(xué)會(ASTM)規(guī)定的最高粘度值(4.0 cSt)，故將這種混合油直接注入發(fā)動機只能作為短期燃料，而不能長期使用?？傊?，由于植物油的高粘度及其酸性成分、游離脂肪酸成分，直接使用植物油或者與石化柴油混合使用，效果都不能令人滿意。

1.3 微乳化法

微乳化法是用甲醇、乙醇、丁醇等表面活性劑和助表面活性劑對植物油進行微乳化，以降低植物油的高粘度。1984年，Ziejewski等[6]用53%堿提取的冬季葵花油、13.3% 的190-Proof乙醇以及33.4%的正丁醇制備了非離子乳化液。其粘度在40℃為6.31 cSt，十六烷值為25，灰分含量低于0.01%。這種乳化液通過200 h的測試，無重大危害出現(xiàn)，但出現(xiàn)厚重積碳、燃燒不完全等現(xiàn)象。2000年，巴西學(xué)者de Castro Dantas等[7]提出了一種新的微乳化體系，該體系由柴油、植物油、水、表面活性劑和助表面活性劑五種成分構(gòu)成，他指出表面活性劑和助表面活性劑的性質(zhì)以及二者的比值、植物油的成分都會影響乳化效果。

2 化學(xué)法

化學(xué)法包括高溫裂解法和酸/堿催化法。高溫裂解法是在無空氣或無氧的環(huán)境下，通過加熱或催化劑輔助加熱使一種底物分子分解為另外幾種較小的分子。酸/堿催化法是采用酸(如硫酸、鹽酸、磺酸)、堿(如氫氧化鈉、甲醇鈉、氫氧化鉀、甲醇鉀)等化學(xué)催化劑催化三酰甘油與低碳醇反應(yīng)生成低碳醇的脂肪酸酯(生物柴油主要成分)的過程。

2.1 高溫裂解法

高溫裂解法生產(chǎn)生物柴油的原料廣泛，可以是植物油、動物脂肪、天然脂肪酸等，但反應(yīng)產(chǎn)物成分很復(fù)雜，包括烷烴、烯烴、二烯烴、芳香烴以及羧酸等。Knothe 等[8]將大豆油進行高溫裂解，餾分由烷烴、烯烴、羧酸組成，其十六烷值為43，超過大豆油的十六烷值(37.9)和ASTM規(guī)定的最低值40。這種餾分在38℃的粘度為10.2 cSt，雖然高于2#柴油的粘度值(1.9～4.1 cSt)，但是遠遠低于大豆油的初始粘度值(32.6 cSt)。用Na2CO3作催化劑、在450℃下高溫裂解油炸過程廢棄的棉籽油，產(chǎn)物的主要成分是C8～C20的烷烴(70%)，其次是烯烴和芳香烴。近年來一些研究者用植物油皂作為反應(yīng)底物進行高溫裂解，其產(chǎn)物富含碳氫化合物。Demirbas[9]研究發(fā)現(xiàn)，葵花油、玉米油、棉籽油、大豆油在337℃裂解的最大脫羧率分別為96.8%、97.1%、97.5%、97.8%。

2.2 酸催化法

總體說來，酸催化法需要在較高的醇油比、較低的溫度與壓力以及高濃度的催化劑條件下進行，以期獲得較高的產(chǎn)物得率。在酸催化過程中，往往通過提高醇油比來提高脂肪酸甲酯的量，但是兩者提高的幅度并不成比例。2006年， Lotero等[10]用硫酸催化大豆油的醇解，當(dāng)甲醇與油的比例為3.3∶1時，甲酯得率為77%；當(dāng)甲醇與油的比例提高到6∶1時，甲酯得率達到87.8%；繼續(xù)提高醇油比到30∶1，甲酯得率才提高到98.4%。盡管酸催化反應(yīng)可以在較低的溫度和壓力下進行，但是游離脂肪酸對催化反應(yīng)的抑制效應(yīng)以及非常慢的反應(yīng)速率，使得酸催化法已不被采用[11]。

2.3 堿催化法

當(dāng)使用高質(zhì)量的植物油反應(yīng)時，堿催化劑顯示出很高的催化能力，但由于反應(yīng)產(chǎn)生的植物油皂抑制了脂肪酸甲酯和甘油的分離[12],導(dǎo)致大量的游離脂肪酸不能轉(zhuǎn)化為生物柴油而被轉(zhuǎn)化為植物油皂。此外，反應(yīng)最好在無水的環(huán)境下進行(至少水分含量不要太高)，因為水會使反應(yīng)向皂化方向轉(zhuǎn)換，生成油皂而降低甲酯的得率。盡管堿催化法對原料的要求較高，但仍然是目前生產(chǎn)生物柴油的主要方法之一。

一般情況下，用過量的KOH或NaOH作催化劑，在60～70℃需要數(shù)小時才能反應(yīng)充分。目前，仍有眾多研究者致力于堿法制備生物柴油的探索。2006年，Meher等[13]用1% KOH作催化劑，甲醇與油的比例為6∶1，在65℃、360 r·min-1混合反應(yīng)3 h，脂肪酸甲酯的產(chǎn)率達到97%～98%。2008年，Rashid等[14]用菜籽油和甲醇為原料，研究了甲醇與菜籽油的比例[(3～21)∶1]、催化劑用量(0.25%～1.5%)、反應(yīng)溫度(35～65℃)、混合強度(160～800 r·min-1)和催化劑類型對反應(yīng)的影響，發(fā)現(xiàn)甲醇與菜籽油比例為6∶1、催化劑KOH的用量為1%、混合強度為600 r·min-1、反應(yīng)溫度為65℃時，催化效率最高，生物柴油的產(chǎn)率達到95%～96%，甲醇或KOH的用量過高或過低都不能轉(zhuǎn)化完全。與KOH和NaOH相比，鈉和鉀的醇鹽(如CH3ONa)具有更高的催化能力，用量為0.5%時，在30 min內(nèi)即能達到98%的產(chǎn)率。雖然KOH 和NaOH的催化活性稍低，但價格便宜，更適用于實際生產(chǎn)[15]。

堿催化法制備生物柴油的優(yōu)點在于，不僅甲醇可以重新利用，而且可以副產(chǎn)在醫(yī)藥等領(lǐng)域具有重要價值的甘油。不過甘油需要及時分離，以免產(chǎn)生對人體有害的甲醛和乙醛。堿催化法同時存在一些缺點，如排放大量pH值高、低氮含量的廢水，抑制微生物的生長而不被降解，破壞環(huán)境。有研究者致力于這種廢水的處理研究。韓國學(xué)者Suehara等[16]從生物柴油生產(chǎn)工廠分離出了一株可降解油脂的膠紅酵母(Rhodotorulamucilaginosa)用于生物柴油廢水的處理。為了使微生物得以在廢水中生長，不僅調(diào)節(jié)廢水的pH值至6.8，還添加了多種氮源(包括硫酸銨、氯化銨和尿素)、酵母提取物、磷酸二氫鉀和七水合硫酸鎂，得出了酵母提取物濃度為1 g·L-1、碳氮比在17～68之間的優(yōu)化工藝，這種方法適合小規(guī)模生物柴油工廠的廢水處理。

3 生物酶法

生物酶法是利用脂肪酶的酯化和轉(zhuǎn)酯反應(yīng)活性，催化油脂和醇反應(yīng)生成生物柴油。與物理法和化學(xué)法相比，用脂肪酶作催化劑制備生物柴油，具有原料選擇性較低、反應(yīng)條件溫和、醇用量少、后處理簡單、無污染物排放、副產(chǎn)物甘油較易分離等優(yōu)點。目前，天然的脂肪酶作為催化劑來生產(chǎn)生物柴油存在著一定的局限性,主要有:(1) 脂肪酶對低鏈醇的轉(zhuǎn)化率較低,致使脂肪酶用量過大、反應(yīng)周期過長，脂肪酶的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)活性有待進一步提高；(2)短鏈醇特別是甲醇對脂肪酶有一定的毒性,酶的使用壽命縮短，生產(chǎn)成本過高，脂肪酶的甲醇耐受性也必須進一步改善。正是這些因素制約著酶法生產(chǎn)生物柴油的大規(guī)模應(yīng)用。

3.1 游離脂肪酶法

游離脂肪酶在反應(yīng)體系中分散不均、容易結(jié)塊，且穩(wěn)定性差，在溫度、pH值和無機離子等外界因素的影響下容易變性失活，使得酯化反應(yīng)速率慢。酶與底物反應(yīng)結(jié)束后，即使酶仍舊具有較高活力，但回收利用困難。因此游離脂肪酶法已很少使用。

3.2 固定化脂肪酶法

與游離脂肪酶相比，固定化脂肪酶具有酶活力高、穩(wěn)定性好、可重復(fù)利用等優(yōu)點。

Yi等[17]用氨基酸修飾的殼聚糖珠固定皺褶假絲酵母(Candidarugosa)脂肪酶。未修飾的殼聚糖珠固定脂肪酶的固載率達到92.7%，但脂肪酶活力僅為10.4%；氨基酸修飾殼聚糖珠固定化脂肪酶的固載率僅為15%～50%，但脂肪酶活力卻高許多，丙氨酸修飾殼聚糖珠固定化脂肪酶活力達49%，亮氨酸修飾殼聚糖珠固定化脂肪酶活力達到51%。Li等[18]通過脒基化反應(yīng)將皺褶假絲酵母脂肪酶共價結(jié)合到聚丙烯腈納米纖維上制成固定化脂肪酶。30℃保存20 d后，固定化脂肪酶仍保留大于95%的活力，而同等條件下游離脂肪酶喪失了80%的活力，連續(xù)使用10次后固定化脂肪酶仍然保留70%的活性。Pahujani等[19]用共價結(jié)合的方法將來自芽孢桿菌(BacilluscoagulansBTS-3)的胞外堿性脂肪酶固定在戊二醛激活的Nylon-6上，其蛋白固載量達到228 μg·g-1，固定化脂肪酶在pH值7.5～9.5內(nèi)保持穩(wěn)定，55℃下保存2 h后仍保留88%的活性，連續(xù)使用8次后殘留酶活為初始酶活的85%。

由于固定化方法和固定化材料的不同，固定化脂肪酶的性能，包括酶活力、穩(wěn)定性、特異性等存在較大的差異。近年來較好的脂肪酶固定化方法還有：采用超濾和交聯(lián)法將脂肪酶固定于聚砜膜表面，將脂肪酶固定于PVA納米纖維膜、化學(xué)修飾的雙峰陶瓷泡沫塑料、甲基修飾的硅膠、殼聚糖納米纖維膜、纖維素材料等。此外，因為必須對脂肪酶進行一定的分離提純才能獲得較高的固定化效率，使得固定化脂肪酶法的生產(chǎn)成本依然較高，限制了其在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用。固定化脂肪酶生產(chǎn)生物柴油今后的研究重點，仍然在于尋找更好的固定化材料和固定化方法，進一步改善固定化酶的相對活力、熱穩(wěn)定性、低碳醇耐受性和催化底物適用范圍等性能。

3.3 全細胞固定法

全細胞固定化法是將產(chǎn)脂肪酶的微生物直接固定到支持物上，從而制備全細胞催化劑，這種方法比固定化酶更為簡便、經(jīng)濟，而且固定化過程可在批量化發(fā)酵時同步完成。根據(jù)全細胞催化劑的發(fā)展歷程和固定方法的差異，主要分為真菌全細胞催化劑、酵母全細胞催化劑、大腸桿菌全細胞催化劑三種。

3.3.1 真菌全細胞生物催化劑

將產(chǎn)脂肪酶的真菌菌絲體固定到載體支持物上，獲得的真菌全細胞催化劑即可用于生物柴油的生產(chǎn)。2001年，Ban等[20]首次將米根霉(Rhizopusoryzae)的菌絲體固定到用聚氨酯泡沫制備的生物支架顆粒(BSP)上獲得真菌全細胞催化劑，并研究了預(yù)處理方法和水分含量對甲醇解作用的影響。他們還發(fā)現(xiàn)向培養(yǎng)基中添加橄欖油和油酸復(fù)合物可顯著提高全細胞催化劑的脂肪酶活力。早期研究者大多用米根霉作全細胞催化劑，直到今天在實際中得到應(yīng)用的也仍然只有米根霉。Zeng等[21]用如下培養(yǎng)基來培養(yǎng)米根霉：3%油，7%Pectone,0.12% NaNO3,0.12% KH2PO4,0.05%MgSO4·7H2O，35℃培養(yǎng)40 h后，100 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基可產(chǎn)生1×106個孢子。過濾收集細胞，用水沖洗，-70℃真空干燥12 h，直接用作催化劑，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)富集細胞和催化生產(chǎn)生物柴油用同一種油時可獲得最大的產(chǎn)量。Ban等[22]在培養(yǎng)基中加入橄欖油和油酸作為添加劑，當(dāng)存在15%水時甲醇解作用增強至90%。他們又添加0.1%戊二醛增強生物支架顆粒的穩(wěn)定性，經(jīng)過6次循環(huán)，每次72 h不連續(xù)培養(yǎng)，甲醇解率為70%～80%。Hama等[23]利用固定在填充床反應(yīng)器(PBR)和攪拌槽反應(yīng)器(STR)中生物支架顆粒上的米根霉全細胞催化劑催化植物油生產(chǎn)生物柴油，發(fā)現(xiàn)固定在PBR中生物支架顆粒上的細胞更為穩(wěn)定。

2008年，Hama等[24]首次采用重組真菌作全細胞催化劑生產(chǎn)生物柴油。他們將異孢鐮刀菌(Fusariumheterosporum)的脂肪酶基因轉(zhuǎn)化到米根霉進行異源表達，用多孔生物量支架顆粒固定重組米根霉細胞，用于催化甲醇解反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)向反應(yīng)體系中添加5%水時，不但可以有效阻止甲醇對脂肪酶的失活效應(yīng)，而且還使部分甘油酯的?；D(zhuǎn)移更加容易，使用10次后甲酯的產(chǎn)率仍可達94%。表明異孢鐮刀菌脂肪酶的重組米根霉全細胞催化劑與野生米根霉全細胞催化劑相比，擁有更高的甲酯得率并且脂肪酶更加穩(wěn)定。

3.3.2 酵母全細胞生物催化劑

3.3.2.1 胞內(nèi)表達脂肪酶全細胞酵母催化劑

2001年，Matsumoto等[25]開發(fā)出了一種酵母工程菌全細胞催化劑制備生物柴油的技術(shù)。他們在啤酒酵母MT8-1內(nèi)超量表達米根霉脂肪酶，并作為全細胞生物催化劑催化制備生物柴油，在無溶劑含水體系中，于37℃反應(yīng)165 h，反應(yīng)混合物中脂肪酸甲酯含量為71%。

3.3.2.2 展示表達脂肪酶全細胞酵母催化劑

很多研究者選擇構(gòu)建展示表達脂肪酶的酵母工程菌作為全細胞催化劑?，F(xiàn)今發(fā)現(xiàn)的酵母表面展示表達系統(tǒng)，大都建立在一種編碼凝集素細胞壁蛋白的FLO1基因的基礎(chǔ)之上。FLO1蛋白由多個功能域組成，包括分泌信號肽、絮凝功能域、GPI錨定結(jié)合信號、細胞膜錨定結(jié)合域。Matsumoto等[25，26]在2002年構(gòu)建了一種表達米根霉脂肪酶的酵母細胞表面展示表達系統(tǒng)，利用了FLO1基因中編碼絮凝功能域的FS和FL基因，目標基因的5′端連接到FS或FL基因上構(gòu)成融合基因，在一種誘導(dǎo)型啟動子UPR-ICL控制下啟動基因表達，目標蛋白的N段被融合到FS和FL蛋白形成融合蛋白，利用這種表面帶有脂肪酶的酵母細胞就可以催化生產(chǎn)生物柴油。利用這種展示表達了FS-米根霉脂肪酶和FL-米根霉脂肪酶的酵母細胞催化甲酯的合成，通過三步添加甲醇反應(yīng)72 h后，甲酯積累量分別達到78.6%和73.5%，而相比之下胞內(nèi)表達米根霉脂肪酶的酵母全細胞催化劑反應(yīng)165 h的甲酯積累量僅為71%。Jiang等[27]將解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)的脂肪酶基因LIPY7和LIPY8與FLO1基因中絮凝功能域的編碼序列融合在一起，在畢赤酵母(PichiapastorisKM71)中進行表達。共聚焦激光掃描顯微鏡檢測顯示脂肪酶成功展示表達在畢赤酵母細胞表面，作者指出這種展示表達了脂肪酶的酵母可作為全細胞催化劑。

3.3.3 大腸桿菌全細胞生物催化劑

Gao等[28]從土壤中分離出一種產(chǎn)脂肪酶的細菌Proteussp.K107，克隆其脂肪酶基因在大腸桿菌BL21中進行表達，將重組大腸桿菌以全細胞催化劑的形式來催化生產(chǎn)生物柴油。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用0.3%(質(zhì)量分數(shù))十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)處理細胞后，其催化活力顯著提高，在最適溫度15℃反應(yīng)12 h后生物柴油的產(chǎn)率接近100%。這是大腸桿菌全細胞催化劑第一次用于生物柴油的生產(chǎn)。與其它全細胞催化劑相比，大腸桿菌全細胞催化劑對甲醇有較高的耐受性，為解決生物柴油生產(chǎn)過程中甲醇致使脂肪酶失活這個難題提供了新思路。

4 無催化劑超臨界法

超臨界法是用處于超臨界狀態(tài)的甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等與三酰甘油進行轉(zhuǎn)酯反應(yīng)制備生物柴油。與傳統(tǒng)的生物柴油生產(chǎn)方法相比，超臨界法具有快速、高效、易連續(xù)操作、無需使用催化劑、受水分和游離脂肪酸的影響小等優(yōu)點。因此超臨界法對于未來大規(guī)模生物燃料的生產(chǎn)，特別是從廢棄油脂中生產(chǎn)生物柴油，擁有光明的前景。但是超臨界法對環(huán)境的苛刻要求(如高溫高壓)、對原料的需求以及相關(guān)成本是限制其廣泛應(yīng)用的主要障礙[29]。

超臨界法制備生物柴油，不需要任何催化劑，只要對轉(zhuǎn)酯反應(yīng)過程的工藝參數(shù)進行優(yōu)化，一般就可達到近似100%的轉(zhuǎn)化率。Demirbas[30]研究發(fā)現(xiàn)，溫度對脂肪酸甲酯的產(chǎn)率具有積極的影響，503 K處理約6 min就達到接近100%的轉(zhuǎn)化率，這是傳統(tǒng)方法難以達到的。Warabi等[31]研究發(fā)現(xiàn)，短鏈醇比長鏈醇具有更高的轉(zhuǎn)化效率。用甲醇處理12 min，甲酯得率接近100%，然而乙醇和丙醇需要45 min才能達到100%的酯化率，丁醇和辛醇的酯化率分別為85%和62%。

5 結(jié)語

生物柴油是一種清潔、優(yōu)質(zhì)的可再生性能源，在世界石油儲量持續(xù)減少的今天，開發(fā)生物柴油具有極其重大的意義。一百多年以來，生物柴油生產(chǎn)技術(shù)日趨成熟。從最初的稀釋混合法等到后來的酸堿催化法，再到生物酶催化法和超臨界法，越來越先進的技術(shù)被開發(fā)出來，生物柴油得率不斷提高，反應(yīng)時間不斷縮短。隨著生物柴油生產(chǎn)技術(shù)的不斷發(fā)展，將涌現(xiàn)出更為優(yōu)良的生產(chǎn)技術(shù)和工藝，并大規(guī)模應(yīng)用于實際生產(chǎn)。

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