陳 靜，金葉玲

(淮陰工學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，江蘇淮安223003)

0 引言

維生素B12(VB12)是生命活動(dòng)中重要的輔酶，是目前已知的唯一含金屬元素的維生素。維生素B12的代謝意義在于它能保持甲硫氨酸的儲(chǔ)備，同時(shí)提供四氫葉酸參加嘌呤、嘧啶和核酸合成，因此，缺乏維生素B12會(huì)影響核酸和某些蛋白的生物合成，以及脂肪酸的代謝。

維生素B12結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，其復(fù)合環(huán)結(jié)構(gòu)(鈷啉環(huán)，中心原子為鈷)非常類似鐵卟啉類蛋白的活性中心結(jié)構(gòu)，因此研究它的氧化還原行為對(duì)于理解金屬卟啉類蛋白或酶的結(jié)構(gòu)與生物功能之間的關(guān)系具有很大的幫助。電化學(xué)模擬用于闡明維生素B12的一些生化反應(yīng)具有很大的優(yōu)勢(shì)。文獻(xiàn)表明，固定良好的維生素B12中的Co能在Co(III)，Co(II)和Co(I)之間進(jìn)行轉(zhuǎn)換，并獲得良好的催化性能。Rusling等和Zagal等都曾以維生素B12為催化劑，用于生物分子的電催化。維生素B12能催化有機(jī)鹵化物的脫鹵反應(yīng)，催化分子氧、胱氨酸和半胱氨酸、聯(lián)氨、硫醇、谷胱甘肽和一氧化氮的還原反應(yīng)，或核酸的合成反應(yīng)。因?yàn)楣潭ú馁|(zhì)和固定方法對(duì)維生素B12的催化活性有很大的影響，所以各種修飾材料，如硅基材料、碳糊、溶膠－凝膠和其他電極修飾材料，和各種固定方法，如吸附法、電聚合反應(yīng)固定和包埋等方法逐漸被提出。

碳納米管擁有良好的導(dǎo)電性、化學(xué)穩(wěn)定性、機(jī)械性能和生物親和性，是制作酶修飾電極的良好固定材料。碳納米管高的比表面積能夠增加蛋白質(zhì)鍵合的位點(diǎn);碳納米管良好的機(jī)械穩(wěn)定性和彈性可以避免修飾膜的破裂;經(jīng)純化或截?cái)嗵幚磉^的碳納米管表面會(huì)帶上－OH，－COOH和 C=O基團(tuán)，能有效改善電極表面的電子傳遞能力，合適的親水性能給其固定的蛋白質(zhì)提供良好的微環(huán)境以保持高的生物催化活性。本文報(bào)道 VB12在CNT/GC電極表面固定及其直接電化學(xué)。實(shí)驗(yàn)表明，固定在CNT/GC電極表面的VB12能進(jìn)行有效和穩(wěn)定的直接電子轉(zhuǎn)移，并能保持良好的生物電催化活性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑

維生素B12購(gòu)自Sigma公司。短多壁碳納米管(直徑:30－50nm，長(zhǎng) ＜600nm，純度 ＞95%)購(gòu)自于成都有機(jī)化工廠(中國(guó)，成都)，其它試劑為分析純，溶液均用二次蒸餾水配制。支持電解質(zhì)為0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液，由 KH2PO4和 H3PO4配制。不同濃度的H2O2溶液均由30%的H2O2溶液用0.1 mol/L的PBS緩沖溶液稀釋得到。將碳納米管配制在二次蒸餾水中，超聲處理使之形成濃度為2 mg/mL無明顯沉降的懸液，每次實(shí)驗(yàn)前均提前再超聲30 min備用。

1.2 維生素B12在CNT/GC電極上的固定

玻碳電極(GC，直徑為3 mm)先在6號(hào)砂紙上磨光，依次用 0.3、0.05 μm 的 Al2O3粉拋光至鏡面，并用二次蒸餾水沖洗干凈，依次在無水乙醇和二次蒸餾水中超聲清洗各2 min，備用。

以微量進(jìn)樣器取25 μL碳納米管分散液和5 μL VB12(5 mg/mL)溶液充分混合，取混合液置于上述經(jīng)拋光處理后的玻碳電極表面上，將室溫下涼干的電極放入0.1 mol/L的 PBS緩沖液中浸泡5分鐘，以脫除沒有吸附的VB12，即得VB12－CNT/GC修飾電極。如不立即使用，將電極保存在4℃冰箱中。用同樣的方法可得CNT/GC電極和VB12/GC電極。

1.3 電化學(xué)實(shí)驗(yàn)

電化學(xué)實(shí)驗(yàn)在蘭力科電化學(xué)分析系統(tǒng)上(天津)進(jìn)行，采用三電極體系，VB12－CNT/GC電極為工作電極，飽和甘汞電極(SCE)為參比電極，螺旋鉑絲為對(duì)電極。所有實(shí)驗(yàn)均在25±2℃下進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 維生素B12在CNT/GC電極上的直接電化學(xué)

圖1a和圖1b分別為GC電極和VB12/GC電極在0.1 mol/L PBS(pH 5)中于0.1 V/s時(shí)的循環(huán)伏安曲線，由圖可知，在實(shí)驗(yàn)的電位掃描范圍內(nèi)，GC電極和VB12/GC電極上均沒有可觀察到的電化學(xué)反應(yīng)發(fā)生。CNT/GC電極(圖1c)在－50 mV處有一對(duì)很寬的氧化還原峰，該對(duì)峰可歸屬于碳納米管表面的含氧基團(tuán);CNT/GC電極具有比GC電極大得多的充電電流，這是因?yàn)镃NT/GC電極具有比玻碳電極更大的表面積所致;CNT/GC電極經(jīng)多次循環(huán)掃描，其伏安曲線幾乎沒有變化，這說明CNT在GC電極表面是很穩(wěn)定的。圖1d是VB12－CNT/GC 電極在0.1 mol/L PBS(pH 5)中的循環(huán)伏安曲線，它有兩對(duì)穩(wěn)定的氧化還原峰。比較圖1d和圖1c可以得出，圖1d中的氧化還原峰是由VB12發(fā)生直接電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)所產(chǎn)生的伏安峰。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，固定良好的維生素B12中的Co能在Co(III)，Co(II)和 Co(I)之間進(jìn)行轉(zhuǎn)換，初步判斷該兩對(duì)峰分別歸屬于Co(III)和 Co(II)，Co(II)和Co(I)之間轉(zhuǎn)換:

0.174 V 處:Vitamin B12(Co III)+e－≒ Vi-tamin B12(Co II)

0.775 V 處:Vitamin B12(Co II)+e－≒ Vitamin B12(Co I)

由圖1可知，100 mV/s時(shí)，VB12直接電子轉(zhuǎn)移的兩對(duì)氧化還原峰電位分別為:Epa(1)=–0.716 V，Epc(1)= –0.834 V，EO＇(1)= –0.775 V;Epa(2)=0.253 V，Epc(2)=0.094 V，EO＇(2)=0.174 V，均為準(zhǔn)可逆過程，這些值與文獻(xiàn)報(bào)道的VB12的式量電位非常相近。CNT促進(jìn)VB12的直接電子轉(zhuǎn)移的能力可能與其納米尺寸及其導(dǎo)電性能有關(guān)外，更重要可能來自CNT表面含氧基團(tuán)的作用，如羧基、羥基和羰基等，這些基團(tuán)在CNT的純化過程中因氧化引入。已有文獻(xiàn)報(bào)道CNT催化細(xì)胞色素c和NADH的電化學(xué)氧化與CNT表面含氧基團(tuán)有關(guān)。

2.2 掃速的影響

圖2是VB12－CNT/GC電極在0.1 mol/L PBS中于不同掃速時(shí)的循環(huán)伏安曲線。

圖2 VB12－CNT/GC電極在0.1 mol/L PBS

由圖2可知，低掃速時(shí)(v＜100 mV/s﹚，VB12的直接電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)的兩對(duì)氧化還原峰(0.17V和–0.775 V附近)的氧化峰電流和還原峰電流均幾乎相等，即ipa/ipc=1，并且峰電流ip與掃描速率v有線性關(guān)系，說明整個(gè)電極過程是受表面過程控制的。隨著掃描速率的增加，氧化峰電位Epa向正方向移動(dòng)，還原峰電位Epc向負(fù)方向移動(dòng)，峰位差增加，但式量電位幾乎不隨掃速的增加而發(fā)生變化(在10 －100 mV/s范圍內(nèi)，EO＇(1)=0.173±0.003 V;EO＇(2)= －0.773 ± 0.004 V)。

由圖2還可以看出，在pH=9的緩沖液中，隨著掃速的增加(＞100mV)，在 －0.4 V和 －0.6 V處均逐漸長(zhǎng)起一對(duì)峰，但－0.6 V處更明顯，且其還原電流均明顯大于氧化電流，表明有催化還原電流存在。當(dāng)溶液pH=4.5時(shí)，上述兩對(duì)峰的氧化峰基本消失，而對(duì)應(yīng)于Co(II)→Co(III)的0.253處的氧化峰增大;與此同時(shí)，分別對(duì)應(yīng)于Co(II)→Co(I)和Co(III)→Co(II)的–0.834 V和0.094 V處的還原峰的峰電流增大，如pH 4.5時(shí)，－0.834 V處的還原電流比pH 9時(shí)的要大136微安，表明酸性條件更有利于催化反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)如實(shí)驗(yàn)前充分通氮除氧，該兩處的峰則均不出現(xiàn)，而當(dāng)以空氣飽和后，則該兩處的峰重新出現(xiàn)，所以實(shí)驗(yàn)初步將此兩處的峰分別歸屬如下:

因?yàn)镃NT/GC電極在同樣條件下沒有出現(xiàn)這兩對(duì)峰，所以VB12的促進(jìn)作用可能是這兩對(duì)峰出現(xiàn)的重要原因。鑒于該兩處均存在明顯的還原電流，所以VB12應(yīng)對(duì)上述可逆反應(yīng)中的還原反應(yīng)有催化作用。Lin等在pH 3的條件下僅觀察到上述兩對(duì)峰的還原峰，與本實(shí)驗(yàn)中pH 4.5時(shí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。

2.3 pH 的影響

圖3是VB12－CNT/GC電極在不同pH值的0.1mol/L PBS緩沖溶液中的循環(huán)伏安圖。循環(huán)伏安實(shí)驗(yàn)表明，兩對(duì)峰的峰電位差均隨pH的減小而增加(0.17V和– 0.775 V附近)，這可能是因酸性條件下存在較強(qiáng)的催化還原，致使低pH下的峰電位差相對(duì)較大;隨著緩沖溶液的pH值增加，氧化和還原峰均向負(fù)方向移動(dòng)，但VB12直接電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)的式量電位受pH的影響較小(移動(dòng)僅為:7 mV/pH)。上述結(jié)果表明VB12在CNT/GC電極表面的直接電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)為無質(zhì)子參與過程;但是因pH的改變會(huì)改變VB12活性中心的外界微環(huán)境，從而也會(huì)影響其直接電子傳遞行為，表現(xiàn)為其式量電位的變化。

圖3 VB12－CNT/GC電極在0.1 mol/L PBS中的循環(huán)伏安曲線pH 分別為 5.0，7.0 ，9.0，掃速為 200 mV/s

實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，隨著pH增加，催化還原電流減小，進(jìn)一步印證3.2中的結(jié)論—VB12催化的反應(yīng)為質(zhì)子參與反應(yīng)。

2.4 維生素B12－CNT/GC電極對(duì)過氧化氫的電催化還原

圖4 VB12－CNT/GC電極在含不同濃度H2O2的0.1 mol/L PBS(pH 5)中的循環(huán)伏安曲線H2O2的濃度分別為(a)0(b)20(c)50 mmol/L，掃速為100 mV/s

為了考查VB12－CNT/GC電極對(duì)過氧化氫的 電催化還原行為，分別在含和不含 H2O2的0.1 mol/L的PBS緩沖溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描。催化實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，a為VB12－CNT/GC電極在不含H2O2的0.1 mol/L PBS(pH=5)中的循環(huán)伏安曲線，在實(shí)驗(yàn)的電位掃描范圍內(nèi)為直接電子轉(zhuǎn)移的兩對(duì)氧化還原峰;b為向0.1 mol/L的PBS溶液(pH=5)中加入20 mmol/L H2O2后的VB12－CNT/GC電極的循環(huán)伏安曲線，可以看到兩對(duì)氧化峰完全消失，還原峰電流增加很大，該電流應(yīng)為VB12－CNT/GC電極對(duì)H2O2的催化還原電流。c為向0.1 mol/L的PBS溶液(pH=5)中加入50 mmol/L H2O2后的VB12－CNT/GC電極的循環(huán)伏安曲線，可以看到催化電流更大。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，固定在碳納米管上的Vb12不僅可以進(jìn)行直接電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)，還可以保持其生物催化活性，有效催化H2O2的電化學(xué)還原。

VB12－CNT/GC電極的催化實(shí)驗(yàn)表明，固定的VB12對(duì)過氧化氫具有靈敏的催化響應(yīng)，催化電流隨H2O2的濃度增大而增加(如圖5所示)。H2O2濃度在4 × 10－5mol/L～4.5 × 10－2mol/L 范圍內(nèi)時(shí)，VB12催化還原電流與H2O2濃度有良好的線性關(guān)系，見圖5中的插圖。

2.5 維生素B12－CNT/GC電極穩(wěn)定性

六根VB12－CNT/GC電極對(duì)20 mmol/L H2O2響應(yīng)的氧化電流平均值為1.23±0.06 mA，說明VB12－CNT/GC電極具有良好的重現(xiàn)性。將VB12－CNT/GC電極保存在緩沖溶液，定期取出考察H2O2在VB12－CNT/GC電極上的氧化峰電流隨保存時(shí)間的關(guān)系，結(jié)果表明，第二天電極的氧化峰電流下降為第一天的93%，22天后其氧化電流仍可保持第一天時(shí)的74%。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，VB12－CNT/GC電極具有較好的催化穩(wěn)定性和儲(chǔ)存穩(wěn)定性良好。

3 結(jié)論

維生素B12在CNT/GC電極表面能進(jìn)行有效、穩(wěn)定的直接電子轉(zhuǎn)移，其循環(huán)伏安曲線上表現(xiàn)出兩對(duì)氧化還原峰，式量電位EO＇幾乎不隨掃速(至少在10～100 mV/s的掃速范圍內(nèi))而變化，其平均值分別為(0.173 ± 0.004)V 和(－0.773 ± 0.004)V(VS.SCE)，pH與式量電位的關(guān)系表明VB12在CNT/GC電極表面的直接電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)為無質(zhì)子參與過程。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明固定在CNT/GC電極上的維生素B12能保持其對(duì)H2O2還原的高催化活性。

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