金 谷，羅光彬，陶金程，牛京京

（沈陽農(nóng)業(yè)大學動物胚胎工程實驗室，沈陽 110161）

人類基因組協(xié)會公布的最新數(shù)據(jù)表明，人類和其他高等生物基因組可能包含約 30 000蛋白編碼基因，其中僅約 15%被認為是在不同發(fā)育階段、不同生理狀態(tài)和不同類型的細胞中表達[1]。所表達的蛋白和相應的信使核糖核酸（mRNA），即所謂的“轉(zhuǎn)錄組”，確定了給定的細胞、組織以及整個生物體的表現(xiàn)型。基因的差異性表達不僅是細胞形態(tài)和功能多樣性的根本原因，而且也是各種生理及病變過程的物質(zhì)基礎，可以引導基因治療的方向性。鑒定不同生理條件下基因的差異表達是分子生物學的重大挑戰(zhàn)之一，多年來，各種差異識別方法得到發(fā)展，例如Northern雜交，扣除（消減）雜交（SHD）、抑制消減雜交（SSH）、差別雜交（篩選）等，但這些方法每次只能檢測一種核糖核酸，而且需要一個相對大量的起始材料[2-4]。美國哈佛醫(yī)學院的兩名科學家以研究與癌癥發(fā)生有關(guān)的基因為目的，于1992年根據(jù)高等生物成熟的mRNA都帶有 poly（A）的特性創(chuàng)立mRNA差異顯示技術(shù)，克服了上述常規(guī)方法的缺陷[5]。許多學者對其做過研究改進，已較成功地應用于動物胚胎發(fā)生、生長因子激活與抑制有關(guān)的基因鑒定與克隆中，這種方法稱為差異顯示反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應（DDRT-PCR）。

1 mRNA差異顯示技術(shù)的原理

mRNA差異顯示技術(shù)和RNA隨機引物聚合酶鏈式反應（RAP-PCR）都是基于這樣一種假設：只要有足夠的引物，那么任意細胞里的任意一個mRNA分子都可以被探測到[5]。而mRNA差異顯示技術(shù)和 RAP-PCR技術(shù)根本的區(qū)別在于其實行mRNA逆轉(zhuǎn)錄時所采用的方法不同：在RAP-PCR中采用的只是隨機的寡聚脫氧核糖核苷酸作為引物，而mRNA差異顯示技術(shù)則是根據(jù)成熟的mRNA 3′端具有 80～200 bp的起保護作用的 poly（A）尾巴這一特性，以一系列 oligo（dT）12MN（N代表 A、C、T、G 4種堿基中的一種，M為A、C、G）引物中的一種錨定于一個亞群的mRNA上，來獲得cD NA。同時，PCR反應、聚丙烯酰胺凝膠電泳和測序等分子生物學的基本技術(shù)也被結(jié)合到了差異顯示技術(shù)中來。mRNA差異顯示技術(shù)過程用一種oligo（dT）12MN的引物逆轉(zhuǎn)錄真核細胞中表達的 mRNA，可獲得 1/12的 cDNA，同時設計5′端一組隨機引物，通過PCR擴增，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳比較。最后將有差異的基因片段從凝膠上切割下來，用相同的錨定引物和隨機引物對分離的片段進行二次擴增，得到差異片段后將該片段克隆、鑒定分析、測序，并同基因庫的序列進行同源性比較或者將差異顯示的DNA克隆測序后作為探針，進行斑點雜交和反向Northern印跡雜交，確定是否是真陽性結(jié)果，以進一步分析其功能。

2 mRNA差異顯示技術(shù)的優(yōu)缺點

2.1 優(yōu)點

mRNA差異顯示技術(shù)迅速超越消減雜交和差別雜交等技術(shù)，成為確定基因差異表達的主要分析方法。該技術(shù)具有以下優(yōu)點：方法相對簡單、便宜，是在大多數(shù)實驗室都能進行的基本實驗操作，如PCR擴增、聚丙烯酰胺凝膠電泳、DNA測序和克??；所需原始材料RNA的量少；目標基因測序是相對獨立的，因為其不需要任何預先的基因組序列信息，這一特點使mRNA差異顯示技術(shù)成為研究同源性基因家族龐大的高突變細菌或植物基因組的適宜方法[6]；差異顯示技術(shù)可同時比較兩種或兩種以上不同來源的mRNA樣品間基因表達差異，鑒定某一過程中特異表達的基因，或檢測基因表達量的多少，而不僅僅是檢測某一細胞系所特有的基因；在一個給定的細胞類型，可篩選出整個轉(zhuǎn)錄組[7]。

2.2 缺點

mRNA差異顯示技術(shù)具有較高的假陽性概率而導致無法確認真正的差異表達片段，據(jù)報道，差異片段表達出現(xiàn)假陽性的概率高達50%[8]。所得的cDNA差異片段較短，由于反轉(zhuǎn)錄是靠近 poly（A）尾巴的mRNA序列，大多只能檢測到位于mRNA 3′端約300 bp的非翻譯區(qū)的序列，往往不能檢測到上游表達的基因信息，對差異片段測序后并不能進行有效的功能預測與分析。

3 mRNA差異顯示技術(shù)的改進

3.1 試驗材料的選擇

對高等哺乳動物而言，特別是人類，獲得足夠多的早期胚胎材料是不易的，要得到大量的克隆胚胎更加困難，而且多個胚胎作為試驗材料研究不同細胞期的基因表達差異存在著不同步的問題。因此試驗材料的局限性成為克隆機理研究中的一大障礙。郁衛(wèi)東等于2003年建立了單個植入前胚胎mRNA差異顯示方法，使高等動物試驗材料的短缺和多胚研究基因表達差異的問題得到解決[9]。

3.2 引物的改進

起初Liang等設計的引物采用了12種錨定寡聚脫氧嘧啶核苷酸引物 oligo（dT）12MN和 20種不同的隨機引物才能把真核細胞中的所有mRNA顯示出來，這不僅費時費力，由于隨機引物長度短導致結(jié)果代表性差，而且得到的擴增片段也較小，所以差異條帶易呈現(xiàn)假陽性結(jié)果[5]。Ito等將原本有兩個固定堿基的3′端錨定引物變?yōu)橹挥幸粋€固定堿基，使原來12種引物減至3種（oligo dT 12A,oligo dT 12C，oligo dT 12G），減少了每個 mRNA樣品對反轉(zhuǎn)錄反應種類的需要，并且把由于簡并性引起的某些RNA代表性差和RNA數(shù)量過多而引起假陽性的現(xiàn)象降到最低程度[10]。隨后又有研究人員對5′端引物進行了改進，隨機引物條數(shù)改為 8條，而且在兩端引物上都帶上了HindⅢ酶切位點，使得差異表達片段的克隆變得更加簡便。

3.3 差異條帶的顯示

最初采用35S作為差異顯示的標記分子，35S標記的相對分辨率高，但在高溫下易分解揮發(fā)，暴光時間長[11]。后有研究者采用32P代替35S，但是仍然有放射性的不足的問題[12]。Lohman等在1995年建立了銀染差異顯示方法，此法可以檢測pg水平核酸的變化，與同位素放射自顯影方法具有相似的靈敏性[13]。采用銀染顯示法不僅快速簡便，而且假陽性率很低。同時該方法避免同位素暴光切帶的盲目性及對人體和環(huán)境造成的危害。

4 在研究基因差異表達中的應用

4.1 在豬中的應用

Liu等于2007年應用mRNA差異顯示技術(shù)發(fā)現(xiàn)豬的一個新基因ADP-ribosylation factor（ARF4），該基因編碼一個含180個氨基酸的蛋白[12]。胡婕等采用SPEDDRT-PCR的方法，采集 2細胞、4細胞、8～16細胞時期的豬孤雌激活胚，挑選不同時期的差異表達產(chǎn)物，經(jīng)過 PCR鑒定后挑選其中的陽性克隆進行測序，篩選了8個代表不同時期表達差異的cDNA片段，編號為DD1～DD8。經(jīng)過同源性分析，發(fā)現(xiàn)其中DD1和DD2沒有相似的數(shù)據(jù)，其余的 DD3～DD8發(fā)現(xiàn)了相似性較高的數(shù)據(jù)[14]。Chang等利用mRNA差異顯示技術(shù)研究了豬早期胚胎（1細胞～8細胞期）基因表達的差異，分析了包括豬α-生長因子結(jié)合蛋白、豬β-生長因子結(jié)合蛋白Ⅱ和豬膠質(zhì)利尿鈉受體基因等[15]。

4.2 在小鼠中的應用

李文雍等采用該法研究了與小鼠的MⅡ卵、2細胞、4細胞胚胎發(fā)育相關(guān)的基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了一條在2細胞期特異表達的片段ed1，測序后經(jīng)Gen-Bank檢索，發(fā)現(xiàn)這是一個功能未知的新基因[16]。Li等采用該技術(shù)通過對不同細胞期小鼠胚胎細胞的比較發(fā)現(xiàn)，ATP酶亞基6編碼基因在小鼠2細胞期胚胎階段特異表達[17]。Lee等在研究胚胎營養(yǎng)素因子3在胚胎發(fā)育中的作用中，對4種不同處理所獲得的小鼠囊胚進行mRNA差異顯示分析，結(jié)果有7種差異表達的蛋白，分別是埃茲蛋白（ezrin）、熱休克蛋白-70、細胞色素C氧化酶亞基-VIIa-L的前體蛋白活化蛋白酶受體2、真核生物翻譯啟示因子 2 β、cullin1、細胞核增殖抗原[18]。

4.3 在植物中的應用

Qixin等利用該技術(shù)研究雜交水稻與其母本的基因表達差異，發(fā)現(xiàn)了一條在雜交水稻中特異表達的基因4B，測序提交GenBank檢索，發(fā)現(xiàn)這是一個功能未知的新基因[19]。Joon等利用該技術(shù)研究蝦脊蘭（Calanthe discolor）和大黃花蝦脊蘭（Calanthe sieboldii）的基因表達差異，共發(fā)現(xiàn)了66個差異表達基因，其中有26個在蝦脊蘭中表達量高，另外40個在大黃花蝦脊蘭中表達量高[20]。

4.4 應用小結(jié)

mRNA差異顯示技術(shù)在研究動物胚胎發(fā)育相關(guān)基因中，已取得卓有成效的研究成果，篩選和發(fā)現(xiàn)了一系列與早期胚胎發(fā)育相關(guān)的侯選基因，而且該技術(shù)的應用不僅僅限于動物領(lǐng)域，還包括水稻和欣賞性植物的領(lǐng)域，為人們了解和掌握生物發(fā)育的分子機制提供了一個有效的方法。

5 展望

自mRNA差異顯示技術(shù)創(chuàng)立以來，人們對此技術(shù)的發(fā)展與應用等方面進行了深入的研究和探索，極大地提高了該技術(shù)的有效性和準確性，隨著該技術(shù)的廣泛應用和不斷完善，將會有越來越多的生命奧秘，如發(fā)育生物學的分子機理、雜種優(yōu)勢機理等。該技術(shù)的應用不會限制在一個界屬或某一項功能上，在應用過程中該方法的不斷完善和發(fā)展，必將產(chǎn)生一種更為高效、準確、簡便的mRNA差異顯示技術(shù)，并在生命科學研究中發(fā)揮日益重要的作用。

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