沈 彤(紹興文理學(xué)院 元培學(xué)院，浙江 紹興 312000)

絲素蛋白調(diào)控磷酸鈣生物礦化的研究進(jìn)展

沈 彤
(紹興文理學(xué)院 元培學(xué)院，浙江 紹興 312000)

總結(jié)了當(dāng)前蠶絲蛋白仿生礦化領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)內(nèi)容，闡述了以不同形態(tài)(溶液、膜、粉末和纖維)存在的絲素蛋白基質(zhì)對(duì)磷酸鈣晶體生長(zhǎng)的調(diào)控作用，介紹了蠶絲蛋白對(duì)磷酸鈣晶體形態(tài)和結(jié)構(gòu)的影響。

蠶絲蛋白；磷酸鈣；基質(zhì)調(diào)控；生物礦化

天然骨是自然界最復(fù)雜的生物礦化系統(tǒng)之一，由無(wú)機(jī)礦物與有機(jī)大分子規(guī)則排列而成。其無(wú)機(jī)相具有多型性，最主要的成分是羥基磷灰石(HA)，又含有CO32-、Cl-、F-、Na+、Mg2+等雜質(zhì)離子，其中CO32-的含量較高，CO32-可取代OH-或PO43-的位置而形成α型或β型碳酸磷灰石(CHA)，一般骨中這兩相同時(shí)存在。此外，骨中還存在非晶磷酸鈣(ACP)、磷酸八鈣(OCP)、二水磷酸氫鈣(DCPD)和六方碳酸鈣等多種礦物相，作為磷灰石的前體相而存在[1]。在整個(gè)礦物形成過(guò)程中，晶體形核的位點(diǎn)、取向、形狀及最終生成的物相都依賴(lài)于礦化過(guò)程中存在的有機(jī)成分及其在礦化生長(zhǎng)階段起到的精密調(diào)控作用。而生物體究竟是怎樣通過(guò)蛋白質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)晶體晶型和形貌的調(diào)控作用的一直是研究者關(guān)注的焦點(diǎn)問(wèn)題。因此，在體外環(huán)境中模擬體內(nèi)環(huán)境，利用有機(jī)模板仿生合成類(lèi)骨材料已成為骨組織工程的重要研究?jī)?nèi)容之一。

蠶絲蛋白是一種性能優(yōu)良的天然生物材料，具有優(yōu)異的力學(xué)性能、生物相容性和生物可降解性，且與膠原蛋白同屬結(jié)構(gòu)蛋白，提取方法簡(jiǎn)便，成本低廉，能促進(jìn)細(xì)胞的黏附、擴(kuò)展和分化，在研究開(kāi)發(fā)骨修復(fù)和替代材料方面，已顯現(xiàn)出廣闊的前景。近年來(lái)，人們嘗試多種方法將蠶絲蛋白制備成不同的結(jié)構(gòu)和形態(tài)，仿生合成生物復(fù)合材料運(yùn)用于骨組織工程。

1 蠶絲蛋白調(diào)控磷酸鈣生物礦化的研究進(jìn)展

1.1 絲素溶液調(diào)控磷酸鈣生物礦化

孔祥東等[2]曾以溶液態(tài)的絲素蛋白為有機(jī)模板，在pH8、室溫條件下調(diào)控磷酸鈣的礦化過(guò)程，研究了不同反應(yīng)時(shí)間收集的磷酸鈣沉淀的形貌、物相及結(jié)構(gòu)。TEM圖譜表明生成的復(fù)合顆粒呈棒狀，其直徑約2～3 nm，其選區(qū)電子衍射表明生成礦物呈多晶環(huán)狀，XRD分析結(jié)果表明所得磷酸鈣為羥基磷灰石晶體，且HA具有(002)擇優(yōu)取向。采用FTIR對(duì)形成的晶體進(jìn)行了化學(xué)結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明HA晶粒是部分碳酸根取代的HA，且礦化過(guò)程絲素蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，其酰胺Ⅱ吸收峰位置發(fā)生藍(lán)移(由1 517 cm-1到1 539 cm-1)，說(shuō)明HA和絲素蛋白間形成強(qiáng)烈的化學(xué)相互作用。孔祥東等[3]還采用UV/可見(jiàn)光譜技術(shù)追蹤研究了蛋白濃度對(duì)磷酸鈣礦化的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)蠶絲蛋白的加入極大地影響了生物礦化的動(dòng)力學(xué)過(guò)程，較高濃度的蠶絲蛋白有助于生物礦化的進(jìn)行。在適宜的反應(yīng)條件下，蠶絲蛋白礦化的動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)有波峰和波谷的出現(xiàn)，出現(xiàn)這種情況主要與相分離有關(guān)。XRD結(jié)果表明通過(guò)波谷前的磷酸鈣主要是非晶磷酸鈣，而波谷后的磷酸鈣成分主要是羥基磷灰石和二水磷酸氫鈣?？紫闁|等[4]所制備的磷酸鈣呈現(xiàn)直徑約2～3 nm的纖維狀，這些納米纖維可以聚集成束，直徑為6～8 nm，長(zhǎng)度可達(dá)30～60 nm。

姚菊明等[5]以堿金屬離子誘導(dǎo)桑蠶絲素蛋白溶液發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)變，研究了蛋白質(zhì)初始結(jié)構(gòu)對(duì)其礦化作用的影響。FTIR、XRD和SEM等測(cè)試結(jié)果顯示，未經(jīng)任何處理的桑蠶絲素蛋白溶液礦化后形成片狀復(fù)合物，其無(wú)機(jī)相以DCPD為主，而經(jīng)過(guò)K+和Na+金屬離子處理后，桑蠶絲素蛋白的構(gòu)象由無(wú)規(guī)線(xiàn)團(tuán)/螺旋結(jié)構(gòu)向β-折疊轉(zhuǎn)變，礦化后成纖維狀，并相互結(jié)合呈現(xiàn)納米級(jí)的三維多孔結(jié)構(gòu)，其無(wú)機(jī)相以熱力學(xué)穩(wěn)定的HA為主。實(shí)驗(yàn)認(rèn)為，絲素蛋白結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為較伸展的β-折疊后，使得更多的親水基團(tuán)暴露在外面，在絲素蛋白分子不斷凝聚成纖過(guò)程中，HA結(jié)晶快速生長(zhǎng)并附著在這些微纖上，最終形成纖維狀的絲素蛋白/HA復(fù)合物。此外，該研究組[6]還在絲素蛋白/磷酸鈣復(fù)合材料形成過(guò)程中加入不同量的Na2SiO3，以評(píng)價(jià)硅對(duì)復(fù)合材料中磷酸鈣晶體生成的影響作用。FTIR和XRD結(jié)果表明，當(dāng)Na2SiO3最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于0.008 %時(shí)，復(fù)合材料中的無(wú)機(jī)相主要是DCPD，也就是骨中HA生成的前體。相反的，高于該質(zhì)量分?jǐn)?shù)，復(fù)合材料中的無(wú)機(jī)相則主要是HA。且Na2SiO3質(zhì)量分?jǐn)?shù)偏低時(shí)，形成的磷酸鈣晶體呈片狀，而更高質(zhì)量分?jǐn)?shù)時(shí)則為棒狀。棒狀晶體相互交聯(lián)成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，這是因?yàn)镠A生成的同時(shí)伴隨著絲素蛋白組裝成微纖維。這一過(guò)程中，絲素蛋白構(gòu)象也從α-螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)榉聪颚抡郫B結(jié)構(gòu)。TG分析結(jié)果表明SiO32-的加入，復(fù)合材料具有更好的熱穩(wěn)定性。該研究組的研究結(jié)果為闡明蛋白質(zhì)的生物礦化過(guò)程及其調(diào)控機(jī)理提供了理論依據(jù)，同時(shí)可以從礦化復(fù)合物的形成來(lái)反映這些微量元素可能對(duì)骨組織形成的影響, 為臨床骨組織的修復(fù)提供一定的參考。

1.2 絲素蛋白膜調(diào)控磷酸鈣生物礦化

姚菊明研究組[7]以絲素蛋白膜為基質(zhì)，在模擬體液中誘導(dǎo)羥基磷灰石晶體在其表面沉積和生長(zhǎng)。利用XRD，SEM，HRTEM，AFM和FTIR等表征手段研究了不同預(yù)處理方法對(duì)羥基磷灰石晶體的形成及其微觀形貌的影響。結(jié)果表明，絲素膜可有效地誘導(dǎo)羥基磷灰石晶體在其表面沉積和生長(zhǎng)，HA晶體呈針狀晶須或由針狀晶須組裝成簇狀形式規(guī)律分布在膜表面。絲素蛋白膜調(diào)控羥基磷灰石晶體生長(zhǎng)的機(jī)制研究表明礦化時(shí)間主要從結(jié)晶度和晶體形成數(shù)量方面對(duì)HA晶體產(chǎn)生影響，而預(yù)處理方法則影響了HA晶體的生長(zhǎng)方式。這主要是由于不同的預(yù)處理，改變了絲素蛋白膜的表面結(jié)構(gòu)，使得蛋白膜表面親水基團(tuán)重新排列，增加了Ca2+和/或PO43-等的結(jié)合位點(diǎn)，且這些位點(diǎn)組成的矩陣具有一定的排列特性，其排列方式與HA晶體的某些晶面上較長(zhǎng)鈣磷離子的排列方式相匹配，致使晶體成核及生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)生擇優(yōu)取向。

Kino等[8]通過(guò)鑄膜及甲醇處理制備了不同氯化鈣含量的絲素蛋白膜，然后將得到的絲素膜浸泡在1.5倍模擬體液(1.5 SBF)中，研究沉積的磷酸鈣晶體結(jié)構(gòu)。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于3 %的絲素膜不發(fā)生礦化作用，而質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于3 %的絲素膜在6 h后發(fā)生礦化作用。X射線(xiàn)衍射和ICP直流等離子體發(fā)射光譜分析表明：HA是由水解后的磷酸鈣生成，這可由衍射強(qiáng)度的變化及1.5 SBF條件下鈣離子和磷酸根離子濃度的變化而知。隨后，將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5 % CaCl2的絲素蛋白膜浸泡在模擬體液中沉淀生成HA晶體。通過(guò)熱壓縮法，即130 ℃和3 MPa條件下處理4 min后制備多層HA/SF 復(fù)合膜和純SF膜(4層)。2種樣品中的β折疊構(gòu)象含量相差不多，分別為55.8 %和55.1 %。將2種膜材料分別置于含有和不含蛋白酶XIV的磷酸緩沖液中處理1～14 d，檢測(cè)膜的膨脹率和體外降解率，同時(shí)對(duì)樣品的質(zhì)量和張力的改變情況進(jìn)行了研究。與純SF膜相比，含有HA的多層膜降解緩慢，且具有更高的機(jī)械強(qiáng)度[9]。

1.3 絲素蛋白粉調(diào)控磷酸鈣生物礦化

Wang等[10]對(duì)絲素蛋白粉進(jìn)行預(yù)處理，通過(guò)濕態(tài)機(jī)械化學(xué)法合成了包含羥基磷灰石和絲素蛋白的納米復(fù)合材料。試驗(yàn)首先將絲素蛋白粉(SF)均勻分散在Ca(OH)2溶液中進(jìn)行堿液預(yù)處理，然后向該懸浮液中加入H3PO4溶液，合成了HA/SF納米復(fù)合材料。堿性溶液處理SF顆粒，增加絲素基質(zhì)和鈣磷離子的接觸位點(diǎn)。使得到的HA晶粒在SF基質(zhì)上沿著晶體學(xué)c-軸擇優(yōu)生長(zhǎng)。合成的復(fù)合材料顯示了70%開(kāi)放多孔結(jié)構(gòu)，且內(nèi)部孔的直徑在40～115 μm之間。絲素蛋白酰胺Ⅱ峰位置的變化表明，堿性溶液預(yù)處理SF加強(qiáng)了HA晶粒與SF基質(zhì)間的化學(xué)作用。這種較強(qiáng)的無(wú)機(jī)－有機(jī)相互作用促進(jìn)了三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)貫穿材料內(nèi)部，并引起材料維氏硬度增加了63 %。Wang等[11]還采用蛋白酶K化學(xué)修飾絲素蛋白來(lái)加強(qiáng)HA基納米復(fù)合材料中無(wú)機(jī)相和有機(jī)相之間的化學(xué)相互作用，取得了同樣的結(jié)果。對(duì)復(fù)合材料中HA結(jié)晶學(xué)性能和材料顯微結(jié)構(gòu)、顯微硬度的研究表明，HA納米晶須在沿c-軸生長(zhǎng)時(shí)表現(xiàn)了較強(qiáng)的取向性自組裝和各向異性的晶體生長(zhǎng)特性。合成的復(fù)合材料顯示了70 %開(kāi)放多孔結(jié)構(gòu)，孔粒徑分布在10～115 μm范圍內(nèi)。由于酶的修飾作用，HA晶簇和SF基質(zhì)的交聯(lián)度提高，增加了復(fù)合材料中的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，使得復(fù)合材料的顯微硬度提高了35 %。此外，HA/SF納米復(fù)合材料中SF含量對(duì)復(fù)合材料微觀結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)性質(zhì)也有很大的影響[12]。SF的加入，使HA沿c-軸和α-軸方向的生長(zhǎng)都受到了抑制。當(dāng)SF的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30 %時(shí)，材料內(nèi)部顆粒形貌相近，HA晶粒分散均勻，材料呈現(xiàn)三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。而當(dāng)其質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加到40 %時(shí)，材料微粒尺寸分布范圍縮小，復(fù)合物的Vickers顯微硬度增加4倍。復(fù)合材料具有多孔微觀結(jié)構(gòu)，孔隙率為62 %～74 %，微孔直徑約70 %分布在40～115 μm之間。

基于Wang等[13]的研究可以發(fā)現(xiàn)，堿液和酶預(yù)處理的絲素暴露出更多的活性位點(diǎn)，誘導(dǎo)HA沿c-軸的擇優(yōu)取向，并有效改善無(wú)機(jī)相和有機(jī)相之間的界面結(jié)合，促進(jìn)復(fù)合材料三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成，增加纖維硬度。

1.4 絲素纖維調(diào)控磷酸鈣生物礦化

人體骨是由無(wú)機(jī)磷灰石晶體和有機(jī)的膠原纖維構(gòu)成的高度有序的三維復(fù)合結(jié)構(gòu)。為了仿生制備該類(lèi)生物復(fù)合材料，一個(gè)令人矚目的戰(zhàn)略便是選擇性地使磷灰石晶體在聚合物上生長(zhǎng)，并對(duì)其結(jié)構(gòu)、機(jī)械強(qiáng)度和功能進(jìn)行控制。Tamada等[14]采用polymethacryloylox yethylphosphate(pMOEP)接枝蠶絲織物。與未處理蠶絲織物相比，pMOEP接枝后，蠶絲織物對(duì)Ca2+吸附能力明顯提高。SEM觀察顯示在模擬體液中浸泡1周之后，pMOEP接枝的蠶絲織物上沉積有微晶體，而未處理的蠶絲織物上卻沒(méi)有發(fā)生結(jié)晶現(xiàn)象。X射線(xiàn)衍射表明微晶中包含有羥基磷灰石。該結(jié)果表明pMOEP接枝后的蠶絲織物比未處理織物更能有效誘導(dǎo)羥基磷灰石晶體形成。

Furuzono等[15]以蠶絲織物為模板，通過(guò)循環(huán)浸泡處理過(guò)程制備了沉積鈣磷鹽的蠶絲復(fù)合材料，并用SEM，XRD，F(xiàn)TIR以及XPS對(duì)沉積的磷酸鈣形貌和結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究。在Ca2+溶液(200 mM CaCl2-tris-HCl緩水溶液，pH7.4)和PO43-溶液(120 mM Na2HPO4)中每隔1 h輪流浸泡后，磷酸鈣的沉積量相應(yīng)增加。SEM觀察表明經(jīng)21次或更多次的循環(huán)浸泡之后，磷酸鈣的沉積厚度已超過(guò)20 μm。XRD顯示經(jīng)過(guò)循環(huán)浸泡，沉積的磷酸鈣晶體的長(zhǎng)徑比增加。FTIR和XPS表明，除了構(gòu)成羥基磷灰石的基團(tuán)，沉淀中還有CO32-，HPO42-和Na+離子。在繼續(xù)浸泡的過(guò)程中，沉積物中HPO42-和Na+含量降低，這與磷酸鈣結(jié)晶度的增加有關(guān)。通過(guò)循環(huán)浸泡，在蠶絲蛋白上沉積的磷酸鈣中是一種缺陷型晶體，和天然骨組織中類(lèi)似，包含CO32-，HPO42-和Na+等離子。因此，這種磷酸鈣-蠶絲蛋白復(fù)合材料可能是具有生物活性的。

Li等[16]通過(guò)在電紡絲制備的具有納米直徑的活化絲素纖維上沉積磷灰石而制備了絲素/磷灰石三維復(fù)合材料?；罨z素由絲素/PEO(polyethylene oxide)水溶液紡絲而得，作為天然骨中非膠原蛋白的類(lèi)似物，該溶液中引入了多聚天冬氨酸(poly-Asp)。絲素蛋白以及酸性poly-Asp充當(dāng)了礦化的模板。磷灰石礦物沿纖維的長(zhǎng)軸方向擇優(yōu)生長(zhǎng)，而在缺少模板蛋白時(shí)，該現(xiàn)象即使在合適的反應(yīng)濃度下也不會(huì)出現(xiàn)。能譜和XRD證實(shí)了沉積的礦物是磷灰石。Zhao等[17]將靜電紡絲制備的絲素?zé)o紡布交替在鈣鹽溶液和磷酸鹽溶液中浸潤(rùn)制得SF/HA復(fù)合支架材料。復(fù)合材料中HA晶體呈現(xiàn)納米尺寸的針狀形態(tài)，直徑為20～60 nm，長(zhǎng)度為100～300 nm。復(fù)合支架材料具有多孔微結(jié)構(gòu)，孔尺寸平均在(163±40 μm)，孔隙率達(dá)70 %～78 %。復(fù)合材料顯示了良好的親水性，其膨脹率和吸水率分別為4.55 %和81.93 %。該材料用于成骨細(xì)胞培養(yǎng)，顯示了良好的細(xì)胞相容性。

2 蠶絲蛋白調(diào)控磷酸鈣生物礦化的發(fā)展趨勢(shì)

仿生礦化是開(kāi)發(fā)新型生物材料的有效方法。蠶絲蛋白作為天然高分子蛋白質(zhì)，具有優(yōu)良的機(jī)械性能和生物相容性，易于加工成型。經(jīng)過(guò)處理得到的絲素蛋白溶液、絲素膜、絲素粉末及絲素纖維均可誘導(dǎo)磷酸鈣等無(wú)機(jī)礦物的沉積和生長(zhǎng)。通過(guò)改變蠶絲蛋白初始結(jié)構(gòu)，對(duì)蠶絲蛋白表面功能基團(tuán)預(yù)處理等手段，可有效調(diào)控磷酸鈣晶體的形貌和化學(xué)結(jié)構(gòu)，這對(duì)認(rèn)識(shí)有機(jī)模板在調(diào)控晶體形核、生長(zhǎng)及微結(jié)構(gòu)的有序組裝過(guò)程中發(fā)揮的調(diào)控作用提供科學(xué)參考，也為研制出更理想的人工骨組織工程材料提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但一直以來(lái)，研究者仍無(wú)法模擬合成出類(lèi)自然骨、牙的硬組織材料，其主要原因是生物體內(nèi)的礦化是在有活細(xì)胞參與及多種調(diào)控情況下，在蛋白基質(zhì)上進(jìn)行的復(fù)雜而有序的精密過(guò)程，因此，未來(lái)的研究不僅是研究礦化位點(diǎn)基質(zhì)組成和位點(diǎn)附近介質(zhì)的影響，還要探索細(xì)胞及基因?qū)ΦV化過(guò)程的調(diào)控作用。

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Developments of Current Researches on Biomineralization of Calcium Phosphate Regulated by Silk Fibroin

SHEN Tong
(Department of Life Science, Yuanpei College, Shaoxing University, Shaoxing 312000, China)

As a natural biomaterial, silk fibroin has outstanding mechanical properties, biocompatibility and biodegradation, which provides an important basis for exploiting this protein for tissue engineering applications. In this paper, biomineralization of calcium phosphate regulated by various forms silk fibroin (solution, film, powder and fiber) was reviewed, the effect of silk fibroin on the morphology and structure of calcium phosphate was analyzed. Thereout, the strategies in biomineralization of calcium phosphate was presumed.

Silk fibroin; Calcium phosphate; Stroma regulation; Biomineralization

O629；O636

A

1001-7003(2010)07-0023-04

2010-04-18

國(guó)家自然科學(xué)基金(10672145)；浙江省自然科學(xué)基金(Y205468)

沈彤(1986－ )，男，本科生，專(zhuān)業(yè)為生物科學(xué)。