林仕梅 羅 莉

（西南大學動物科技學院,淡水生物生殖與發(fā)育教育部重點實驗室,重慶 400716）

高密度精養(yǎng)模式的可持續(xù)發(fā)展,要求采用以高脂肪提供能量來節(jié)約蛋白質(zhì)的策略,進而達到降低氮、磷排放,保護養(yǎng)殖水環(huán)境的目的。但當飼料中脂肪水平超過需求量時,會導致魚體的脂肪沉積增加,從而影響水產(chǎn)品品質(zhì)和貨架壽命,嚴重時甚至會導致大量脂肪在魚肝細胞內(nèi)堆積,引起肝細胞變性、壞死,導致肝功能下降甚至衰竭,最后引起魚發(fā)病甚至死亡[1]。近年來,魚粉價格居高不下,植物性蛋白源在羅非魚養(yǎng)殖中的使用量不斷加大,植物性蛋白源的不合理或大量使用會對羅非魚肝臟的生理機能帶來負面影響[2],使其處于亞健康狀態(tài),從而影響其正常的生長。因此,如何保證養(yǎng)殖水產(chǎn)動物肝臟的健康,則成為動物營養(yǎng)學家和飼料生產(chǎn)者面臨的又一個難題。目前有關水產(chǎn)養(yǎng)殖動物抗脂肪肝物質(zhì)的研究往往集中在單一物質(zhì)的使用效果上[3-5],而關于牛磺酸、甜菜堿、左旋肉堿等這些抗脂肪肝物質(zhì)的復合使用還未見報道。為此,本試驗以奧尼羅非魚（Oreochrom is niloticus×O.aureus）為試驗對象,在實用飼料配方的基礎上,進一步探討復合降脂因子對羅非魚生長和健康的影響,以便為防治魚類營養(yǎng)性脂肪肝提供理論依據(jù)和解決方案。

1 材料和方法

1.1 試驗飼料

在實用飼料配方的基礎上,通過添加豆油,配制成3種脂肪水平的等氮（粗蛋白質(zhì)含量為30%）試驗飼料,試驗飼料1、2和3的脂肪水平分別為4.5%、6.5%和8.5%。在試驗飼料3的基礎上添加0.1%的復合降脂因子（牛磺酸︰甜菜堿︰左旋肉堿=3︰4︰2）,并相應減少次粉的用量,配制成試驗飼料4。試驗飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。飼料原料均粉碎過40目篩,飼料調(diào)質(zhì)溫度為80℃,分別制成直徑為1.5 mm的硬顆粒飼料,60℃烘干后,保存于-15℃冰柜中備用。

表1 試驗飼料組成及營養(yǎng)水平（風干基礎）Table 1 Composition and nutrient levels of experimen taldiets（air-dry basis）%

1.2 試驗設計與飼養(yǎng)管理

試驗魚選用當年培育的全雄性奧尼羅非魚魚苗,取自廣東茂名三高魚種場。試驗魚馴食適應環(huán)境2周后,選取體質(zhì)健壯、規(guī)格整齊、平均體重為（4.21±0.09）g的奧尼羅非魚360尾,隨機分成4組,分別飼喂試驗飼料1、2、3、4。每組設3個重復,每個重復30尾魚,放養(yǎng)在室內(nèi)淡水循環(huán)玻璃水族箱（有效體積為200 L）中,日投喂率為體重的4%～8%,每天08:00、12:00和17:00各投喂1次,每2周稱重1次,調(diào)整投飼量。每天早上清除箱內(nèi)糞便,并換水1/ 3。飼養(yǎng)時間為8周。養(yǎng)殖水源曝氣自來水,試驗期間水溫為（28.3±0.8）℃,pH為7.14±0.40,溶解氧為（6.25±0.70）m g/L,氨氮為（0.05± 0.01）mg/L。

1.3 樣品制備與分析

飼養(yǎng)試驗結(jié)束后,禁食1 d后稱重,每箱取3尾魚作為全魚體成分分析樣品;另取3尾魚采用搗毀脊髓法處死,取出肝胰臟,立即放入液氮罐中速凍,然后轉(zhuǎn)入-80℃低溫冰箱保存。肝胰臟勻漿液在10 000×g4℃條件下離心30 m in,取上清液作為酶活性分析樣品,置-20℃冰箱待用。

飼料原料及魚體樣品均在105℃烘干至恒重,然后進行營養(yǎng)成分測定。采用凱氏定氮法測定樣品的總氮含量,將測定結(jié)果乘以6.25即得粗蛋白質(zhì)含量,粗脂肪含量采用索氏抽提法,粗灰分含量采用高溫（550℃）灰化法測定[6]。

肝胰臟谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT,EC 2.6.1.1）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT,EC 2.6.1.2）、超氧化物歧化酶（SOD,EC 1.15.1.1）、過氧化氫酶（CAT,EC 1.16.1.6）活性以及丙二醛（MDA）含量采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒進行測定。GOT、GPT的活性單位定義為每毫克組織蛋白與基質(zhì)在37℃下作用60 m in,生成1μm ol丙酮酸所需要的酶;SOD的活性單位定義為每毫克組織蛋白在1m L反應液中SOD抑制率達50%時所反應的SOD量;CAT的活性單位定義為25℃,pH 7.0條件下,每分鐘分解1μm ol過氧化氫所需的酶。蛋白質(zhì)含量采用Brad ford[7]方法測定。

1.4 計算公式

特定生長率（specific growth rate,SGR,%/d）= 100×[ln末重（g）-ln初重（g）]/試驗天數(shù)（d）;

蛋白質(zhì)效率（protein ef ficiency ratio, PER,%）=100×魚體增重（g）/蛋白質(zhì)攝人量（g）;

飼料系數(shù)（feed conversion ratio,FCR）=總干物質(zhì)攝食量（g）/魚體總增重（g）;

臟體比（viscerosomatic index,VSI,%）= 100×內(nèi)臟重濕重（g）/魚體重濕重（g）;

肝體比（hepatosomatic index,HSI,%）= 100×肝胰臟重濕重（g）/魚體重濕重（g）。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

除成活率外,數(shù)據(jù)均以平均值±標準誤表示,采用SPSS 11.0對所得數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（One-w ay ANOVA）,若差異達到顯著,則進行Tukey多重比較,顯著性水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料脂肪水平和復合降脂因子對羅非魚生長性能的影響

由表2可知,隨著飼料脂肪水平的增加,羅非魚的SGR顯著增加（P＜0.05）。羅非魚的FCR隨著飼料脂肪水平的增加而降低,其中1組顯著高于2組和3組（P＜0.05）。羅非魚的PER表現(xiàn)出與FCR相反的趨勢,即隨飼料脂肪水平的增加而升高,其中3組顯著高于1組（P＜0.05）。在8.5%脂肪水平下添加0.1%復合降脂因子后,羅非魚的FCR顯著降低（P＜0.05）,PER顯著升高（P＜0.05）,SGR有上升的趨勢（P＞0.05）。試驗期間,各試驗組羅非魚的成活率均為100%。

表2 飼料脂肪水平和復合降脂因子對羅非魚生長性能的影響Table 2 Effec ts of dietary lipid level and compound lipotropic agent on grow th perform ance of tilapia

2.2 飼料脂肪水平和復合降脂因子對羅非魚體組成的影響

由表3可知,各組羅非魚的臟體比和肝體比均無顯著差異（P＞0.05）。羅非魚的肝脂和體脂（魚體粗脂肪）含量3組顯著高于其他各組（P＜0.05）,而其他各組間差異不顯著（P＞0.05）。飼料脂肪水平和復合降脂因子對羅非魚魚體干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)和粗灰分含量的影響差異均不顯著（P＞0.05）。

表3 飼料脂肪水平和復合降脂因子對羅非魚體組成的影響Tab le 3 Effects of dietary lipid level and com pound lipotropic agent on body composition o f tilapia%

2.3 飼料脂肪水平和復合降脂因子對羅非魚肝胰臟代謝、抗氧化指標的影響

由表4可知,隨著飼料脂肪水平的增加,羅非魚的肝胰臟GPT和GOT活性均顯著降低（P＜0.05）。在8.5%脂肪水平下添加0.1%復合降脂因子后,羅非魚的肝胰臟GPT和GOT活性顯著提高（P＜0.05）,并與脂肪水平為4.5%時無顯著差異（P＞0.05）。4組羅非魚的肝胰臟SOD活性顯著低于2組和3組（P＜0.05）,其他各組間差異不顯著（P＞0.05）。隨著飼料脂肪水平的增加,羅非魚的肝胰臟CAT活性顯著升高（P＜0.05）。在8.5%脂肪水平下添加0.1%復合降脂因子后,羅非魚的肝胰臟SOD和CAT活性顯著降低（P＜0.05）,并與脂肪水平為4.5%時無顯著差異（P＞0.05）。羅非魚的肝胰臟MDA含量隨著飼料脂肪水平的增加而升高,且3組顯著高于1組和2組（P＜0.05）。在8.5%脂肪水平下添加0.1%復合降脂因子后,羅非魚的肝胰臟MDA含量顯著降低（P＜0.05）,并與脂肪水平為4.5%時無顯著差異（P＞0.05）。

表4 飼料脂肪水平和復合降脂因子對羅非魚肝胰臟代謝、抗氧化指標的影響Table 4 Effects of dietary lipid level and com pound lipotropic agent on indices ofm etabolic and antioxidant in hepatopancreas of tilapia

3 討 論

本試驗結(jié)果表明,隨著飼料脂肪水平的增加,羅非魚的生長性能提高,以8.5%脂肪水平生長效果最好,這與Hanley[8]的研究結(jié)果一致。Jauncey等[9]建議羅非魚飼料中的脂肪水平為6%～10%,也有研究指出羅非魚幼魚飼料中適宜的脂肪水平為12%[10],而甘暉等[11]研究指出奧尼羅非魚幼魚飼料中適宜的脂肪水平為4%（半純化飼料）。造成這種差異的原因可能與飼料脂肪酸組成、飼料配方、魚類生長階段、飼養(yǎng)條件等有關。本研究的試驗設計立足我國的生產(chǎn)實際,其脂肪水平也符合羅非魚的建議需求量。高能飼料固然能提高飼料效率,并降低氨氮、磷及有機物的排放,但容易提高動物體脂水平,降低產(chǎn)品品質(zhì)[12]。已有研究指出羅非魚飼料中脂肪水平達到6%時,會產(chǎn)生一定的蛋白質(zhì)節(jié)約效應[13]。但本研究中各脂肪水平均沒有表現(xiàn)出明顯的蛋白質(zhì)節(jié)約效果,僅在脂肪水平為8.5%時表現(xiàn)出體脂含量的提高。Han ley[8]研究指出在飼料蛋白質(zhì)不缺乏的情況下,羅非魚不能有效利用脂肪作為能源。本研究是否是因為蛋白質(zhì)水平較高使得蛋白質(zhì)節(jié)約效應沒表現(xiàn)出來值得進一步探討。此外, Chou等[10]在尼羅羅非魚上的研究發(fā)現(xiàn),高脂肪水平會降低其產(chǎn)脂酶的活性。

眾所周知,脂肪是水產(chǎn)動物體內(nèi)重要的貯能物質(zhì),但飼料中脂肪含量過高會導致魚體出現(xiàn)脂肪肝[2]。肝脂含量的多少是反映肝健康的重要指標,本研究中高脂肪水平（8.5%）使得羅非魚肝脂含量顯著增加,盡管沒有影響羅非魚的生長性能（可能是因為本試驗養(yǎng)殖周期僅僅為8周）,但長時間飼喂不可避免的會加重肝臟負荷,降低肝的生理機能,影響?zhàn)B殖動物的生長性能,嚴重的甚至會引起魚類死亡。魚類的肝脂主要來自對飼料中脂肪的直接吸收以及飼料中過量蛋白質(zhì)和糖類的轉(zhuǎn)化合成,因此,可以通過調(diào)節(jié)和控制肝臟中脂肪的來源和去路,實現(xiàn)對脂肪肝的預防和治療。目前研究發(fā)現(xiàn),?；撬醄14-15]、甜菜堿[16-17]、左旋肉堿[18]是魚類較理想的抗脂肪肝因子,飼料中補充這些物質(zhì)能夠有效降低水產(chǎn)養(yǎng)殖動物肝脂含量。本試驗結(jié)果表明,上述物質(zhì)的復合使用亦能夠有效降低羅非魚肝脂含量,改善羅非魚的生理機能。由于這些抗脂肪肝物質(zhì)具有不同的生理生化機制以及抑制水產(chǎn)養(yǎng)殖動物脂肪肝形成的作用機理不同,因此,如何調(diào)配好這些物質(zhì)來有效降低養(yǎng)殖動物肝脂含量,是值得進一步深入研究的問題。

當魚類肝臟病變時（如脂肪肝）,由于肝組織的損傷,導致肝細胞破壞或細胞膜通透性增加,致使肝細胞中的酶滲入血液,使血液中的酶活性增加[2]。因此,肝胰臟轉(zhuǎn)氨酶活性反映了肝胰臟受損傷的程度,肝胰臟GPT、GOT活性越低,表明肝臟受損傷越嚴重。本試驗結(jié)果表明,飼料脂肪水平增加,羅非魚的肝胰臟GPT和GOT酶活性顯著降低;在8.5%脂肪水平下添加0.1%復合降脂因子后,羅非魚的肝胰臟GPT和GOT酶活性又顯著升高（P＜0.05）。這表明復合降脂因子對肝臟起到一定的保護作用,從而促進了營養(yǎng)物質(zhì)的消化利用。

MDA是脂肪酸過氧化代謝產(chǎn)物,被認為是肝臟損傷的指標[19]。本試驗中,脂肪水平為8.5%時羅非魚肝胰臟的MDA含量較其他脂肪水平增加了近1倍,這表明羅非魚肝臟脂肪過度沉積的同時大量脂肪酸發(fā)生了過氧化。魚體內(nèi)有天然的抗氧化系統(tǒng)去除脂肪酸氧化產(chǎn)物,以維持正常的生理功能,其中包括CAT、SOD等抗氧化酶[20]。動物細胞生存要求適當?shù)难趸c抗氧化平衡,但脂肪酸被氧化的量一旦超過體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的清除能力,肝臟可能產(chǎn)生更嚴重的損害。CAT和SOD分別作用于過氧化氫和超氧自由基。SOD是底物誘導酶,它的活性升高說明體內(nèi)超氧自由基或羥自由基含量上升,從而導致動物體內(nèi)氧化壓力過大;CAT能特異性清除體內(nèi)過多的過氧化氫,保護細胞免受過氧化損傷,這2種酶的測定常用于間接反映體內(nèi)自由基反應的動態(tài)變化及組織損傷情況。本試驗結(jié)果顯示,隨著飼料脂肪水平增加,羅非魚肝胰臟SOD和CAT活性均有不同程度的升高,這表明魚體處于氧化應激的狀態(tài)。而在8.5%高脂肪水下添加0.1%復合降脂因子后,SOD和CAT活性得到顯著改善,這說明復合降脂因子具有很好的抗氧化活性,推測其肝臟保護作用可能是源于其較高的體內(nèi)抗氧化活性。

4 結(jié) 論

①增加飼料脂肪水平會顯著提高羅非魚的生長性能,但高脂肪水平（8.5%）會降低羅非魚肝臟的生理機能。

②添加復合降脂因子能夠顯著改善羅非魚肝脂含量和肝胰臟酶活性,繼而促進生長。

③復合降脂因子可以作為一種安全高效的口服保肝劑應用于羅非魚的養(yǎng)殖生產(chǎn)。

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Au thor,LIN Sh imei,associate professor,E-mail:linsm198@163.com

（編輯 菅景穎）