袁磊 韓坤(漯河醫(yī)學高等?？茖W校,河南 漯河 462002)

1-磷酸鞘氨醇(Sphingosine-1-phosphate,S1P)是近年來發(fā)現(xiàn)的具有重要生理功能的一種膜磷脂類代謝產(chǎn)物。研究證實,S1P可通過相應受體激活PI3K-Akt信號通路,進而減輕缺血再灌注損傷[1,2]。Akt是S1P發(fā)揮心肌保護作用的關(guān)鍵分子。本研究通過建立缺氧/復氧乳鼠心肌細胞損傷模型,觀察1-磷酸鞘氨醇(Sphingo-sine-1-phosphate,S1P)預處理對缺氧/復氧乳鼠心肌細胞磷酸化Akt1水平的影響,探究S1P是否還通過激活Akt1進而減輕心肌細胞缺氧復氧損傷,保護心肌細胞。

1 材料與方法

1.1 動物

出生72h內(nèi)的大鼠乳鼠,雌雄均可,狀態(tài)良好,購于鄭州大學醫(yī)學院動物實驗中心,動物合格證號：醫(yī)動字010346號。

1.2 藥品

DMEM高糖培養(yǎng)(長春博德生物公司);新生小牛血清(武漢三利生物);胰蛋白酶(美國Amresco);1-磷酸鞘氨醇(S1P)、渥曼青霉素(Wortmannin)、兔抗鼠磷酸化 Akt1抗體(Thr473)和辣根酶標記山羊抗兔IgG(Sigma)。

1.3 方法

1.3.1 大鼠乳鼠心肌細胞原代培養(yǎng)

將出生72h內(nèi)的大鼠乳鼠心室肌剪碎,用0.125%胰蛋白酶進行消化,利用差速貼壁法純化心肌細胞,加入20%DM EM培養(yǎng)基,送37℃、95%O2+5%CO2的二氧化碳孵育箱中培養(yǎng),每隔24h更換一次細胞培養(yǎng)液,待單層心肌細胞覆蓋瓶底達80%以上時進行實驗。

1.3.2 制備缺氧/復氧心肌細胞損傷模型

待心肌細胞生長至匯合狀態(tài)時(72h),更換細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)12h,使細胞同步化;然后置于92%N2及5%CO2孵箱中缺氧6h再恢復正常條件培養(yǎng)4h,造成缺氧/復氧損傷所致細胞凋亡模型。

1.3.3 實驗分組及給藥

實驗分成三組：正常對照組(Control group),缺氧/復氧組(H/R group),S1P預處理缺氧/復氧組(S1P+H/R group),自模型制作前2d開始,每天實施S1P預處理2h,S1P終濃度為2.0μ mol?L-1。

1.3.4 臺盼蘭排斥法檢測細胞死亡率

將細胞懸液和0.4%臺盼藍染液按1：1體積比混合后加蓋玻片,1min后計數(shù)100個細胞,活細胞透明,死細胞染成藍色,著色細胞數(shù)計為N,用死細胞占計數(shù)細胞中的百分比表示細胞死亡率,即(N/100)×100%。

1.3.5 心肌細胞內(nèi)磷酸化Akt1含量檢測

采用Western Blot方法。提取各實驗組細胞內(nèi)總蛋白,進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,按目的蛋白的位置來切膠;將目的蛋白從SDS聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,封閉PVDF膜;依次加入一抗(兔抗鼠磷酸化 Akt抗體)和二抗(辣根酶標記山羊抗兔IgG),以上步驟之間均充分孵育和洗滌;然后將PVDF膜放入顯色液進行顯色,并拍照保存;用圖像分析軟件檢測蛋白區(qū)積分光密度值(Iintegrated optical density,IOD),用蛋白區(qū)IOD值表示各組蛋白表達量,以p-Akt1與Tublin的積分光密度比值(R值)作為p-Akt1的相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 S1P預處理對缺氧/復氧心肌細胞死亡率的影響

H/R組較Control組細胞死亡率顯著升高(P＜0.001);S1P+H/R組細胞較H/R組死亡率顯著降低(P＜0.002),這表明S1P預處理能夠明顯減輕缺氧/復氧損傷保護心肌作用。結(jié)果見表1。

表1 各實驗組細胞死亡率(,n=3)

表1 各實驗組細胞死亡率(,n=3)

注：與對照組相比,＊P＜0.005,＊＊P＜0.001;與缺氧復氧組相比,#P＜0.002

組別 細胞死亡率(%)對照組 1.52±2.13缺氧復氧組 47.14±2.66＊＊S1P預處理+缺氧復氧組 21.42±2.72＊#

2.2 Tublin(微管蛋白)和磷酸化Akt1的蛋白質(zhì)印跡

內(nèi)參蛋白Tublin的分子量為51kd,磷酸化Akt1(p-Akt1)是分子量為60kd的蛋白質(zhì)分子。Tublin和p-Akt1的western blot結(jié)果如圖1。

圖1 WesternBlot測定 Tublin和 p-Akt1的蛋白表達情況

2.3 分析蛋白條帶的積分光密度值和R值

以p-Akt1與Tublin的IOD比值(R值)作為 p-Akt1的相對表達量(表2)。結(jié)果顯示,Control組R值最低,這表明在正常心肌細胞內(nèi)僅有少量Akt1被活化;H/R組R值較Control組輕度升高(P＜0.05),這表明缺氧復氧刺激能夠輕度激活Akt1;S1P+H/R組R值較 H/R組顯著升高(P＜0.01),說明S1P預處理能夠顯著提高Akt1的磷酸化水平。

表2 Tublin和p-Akt蛋白條帶的積分光密度值和R值(,n=3)

表2 Tublin和p-Akt蛋白條帶的積分光密度值和R值(,n=3)

注 ：與對照組相比,＊P＜0.05,＊＊P＜0.001;與缺氧復氧組相比,#P＜0.001

組別 IOD Tublin p-Akt1R對照組 170.33±2.58 31.326±0.736 0.1838±0.0031缺氧復氧組 171.11±2.16 33.494±0.919 0.1957±0.0033＊S1P預處理 +缺氧復氧組 169.23±2.37 116.90±1.47 0.6908±0.0018＊＊##

3 討論

1-磷酸鞘氨醇(Sphingosine-1-phosphate,S1P)是近年來發(fā)現(xiàn)的具有重要生理功能的一種膜磷脂類代謝產(chǎn)物。它既可作為一種細胞內(nèi)第二信使,又可作用于細胞膜表面特定的受體而發(fā)揮其重要的生物學功能。S1P與細胞的多種生命活動密切相關(guān),包括細胞的增殖、分化、凋亡和遷移等。

近年研究發(fā)現(xiàn)細胞凋亡是心肌缺血再灌注損傷過程中心肌細胞死亡的重要機制之一,而PI3K-Akt信號通路正是近年來備受關(guān)注的凋亡抑制通路之一。研究證實,S1P可通過與S1P2受體和S1P3受體結(jié)合,激活 PI3K-Akt信號通路,使細胞內(nèi)磷酸化Akt水平升高,進而減輕缺血再灌注損傷,抑制心肌細胞凋亡,發(fā)揮心肌保護作用[1,2]。Akt的下游信號包括：Bad、caspase-9 、GSK3 、FH 轉(zhuǎn)錄因子、Iκ B 激酶。 目前對 Akt的抗凋亡機制更傾向于其維持線粒體膜的完整性,Akt可使Bcl-2家族成員Bad的Ser136磷酸化而促使它和14-3-3蛋白結(jié)合,Bcl-2或Bcl-xL得以脫離Bad的抑制,調(diào)節(jié)線粒體通透性,阻止細胞色素C(CytC)和凋亡誘導因子(AIF)的釋放,發(fā)揮抗凋亡作用,這可能是Akt促進細胞存活的重要機制之一[3]。

本研究以缺氧/復氧心肌細胞損傷模型為研究對象,采用Western Blot方法,通過檢測心肌細胞內(nèi)磷酸化Akt1水平,旨在探究S1P是否能通過非PI3K依賴的信號通路激活Akt1。實驗結(jié)果顯示,H/R組R值較Control組輕度升高(P＜0.05),這表明缺氧復氧刺激能夠輕度激活Akt1,但意義不大;H/R+S1P組磷酸化Akt1水平在各實驗組中最高(P＜0.001),這表明S1P能夠顯著提高缺氧復氧心肌細胞內(nèi)Akt1的磷酸化水平;當加入PI3K抑制劑Wortmannin后,PI3K受到抑制,Akt1是PI3K的下游分子,則Akt1的激活也被Wortmannin抑制,心肌細胞內(nèi)磷酸化Akt1含量較H/R+S1P組明顯下降(P＜0.001),但H/R+S1P+W組心肌細胞內(nèi)磷酸化Akt1水平仍較H/R組高(P＜0.001),這說明Wortmannin僅能部分阻斷S1P對Akt1的活化。

綜上所訴,S1P對Akt1的激活還存在著非PI3K依賴的信號通路,這也將為進一步探索S1P誘導的心肌保護作用機制提供了新思路。

1 Means CK,Xiao CY,Li ZJ,et al.Sphingosine-1-phosphate S1P(2)and S1P(3)receptor-mediated Akt activation protects against in vivo myocardial ischemia-reperfusion injury[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2007,292(6)：H2944-H2951.

2 Del Re DP,Miyamoto S,Brown JH.Focal Adhesion Kinase as aR-hoA-activable Signaling Scaffold Mediating Akt Activation and Cardiomyocyte Protection[J].J Biol Chem,2008,283(51)：35622-35629.

3 Downward J.How BAD phosphorylation is good for survival[J].Nat Cell Biol,1999,1(2)：E33-E35.