劉華 蘭海濤 劉紅 鄭倩 陳武寧

(川北醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室,四川 南充 637100)

最新糖尿病流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果標(biāo)明,中國糖尿病患病人數(shù)已經(jīng)超過9200萬,成為世界上糖尿病患者最多的國家,而且還在呈快速增長趨勢[1]。糖尿病患者中90%以上是2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM),所以,對 T2DM 病理機(jī)制和防治進(jìn)行研究,具有重要的臨床和社會價(jià)值。結(jié)合我國實(shí)際,采用價(jià)廉有效的中草藥結(jié)合部分西藥,用于糖尿病及其并發(fā)癥的防治,是近年來國內(nèi)臨床與科研工作者積極探索的一種新模式。根據(jù)糖尿病的病理損害機(jī)制,防治應(yīng)以降糖降脂、改善循環(huán)功能及保護(hù)腎功能為主[2]。采用Bre聯(lián)合纈沙坦治療糖尿病模型大鼠,研究其對T2DM大鼠,特別是腎臟功能的保護(hù)作用及機(jī)制,目前還未見有文獻(xiàn)報(bào)道。燈盞花素(Breviscapine,Bre)是從燈盞花中分離出的一類黃酮類成分,主要含燈盞乙素、少量燈盞甲素和其它黃酮成分。大量研究表明,黃酮類化合物具有降低血脂、抗炎、調(diào)節(jié)免疫、抗氧化等作用[3]。有文獻(xiàn)報(bào)道,Bre能夠使糖尿病患者和糖尿病腎病大鼠的尿蛋白減少,減輕腎臟肥大[4]。纈沙坦是血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑,能夠降低血壓,改善機(jī)體血液循環(huán)。本實(shí)驗(yàn)以高糖高脂飲食加小劑量STZ腹腔注射誘發(fā)的T2DM大鼠為研究對象,給予12 w Bre聯(lián)合纈沙坦治療,探索該治療方案對T2DM大鼠腎功能的影響及作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與儀器

鏈脲佐菌素(STZ,Sigma),血糖、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)及鈉鉀-ATP酶檢測試劑盒(南京建成生物公司),胰島素放射免疫檢測試劑盒(北京北方生物技術(shù)研究所),燈盞花素(云南龍峰藥業(yè)公司),纈沙坦(海南皇隆制藥廠)。快速血糖測定儀(三諾SXT-1型,長沙)。

1.1.2 動物及飼料

3月齡雄性 Wistar大鼠,一級,體質(zhì)量(195±16)g。常規(guī)飼料：57%碳水化合物,22%蛋白質(zhì),6%脂肪,8%纖維素,7%其它成分。高能飼料(60%常規(guī)飼料,20%蔗糖,15%豬油,5%膽固醇)。動物及飼料均由四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所提供,動物合格證號：SCXK(川)2004-15。

1.2 方法

1.2.1 動物模型建立與分組

T2DM大鼠模型建立參照本實(shí)驗(yàn)室以前的方法[5],4w高能飼料喂養(yǎng),空腹12 h后給予25 mg?kg-1的STZ一次性尾靜脈注射,繼續(xù)高能飼料喂養(yǎng)4 W,然后采尾靜脈血測定空腹血糖(FBG)、血清胰島素(FINS),并計(jì)算胰島素敏感指數(shù)(ISI)[6],最后選取符合T2DM條件的20只大鼠作為模型,其余淘汰。實(shí)驗(yàn)動物設(shè)立三組：正常對照組(A);模型對照組(B);治療組(C)。參照文獻(xiàn)[7,8],纈沙坦與Bre各 20 mg?kg-1?d-1。纈沙坦用蒸餾水配成1%濃度灌胃,每日1次,Bre腹腔注射,上下午各1次,每次10 mg?kg-1。對照組每次等量蒸餾水灌胃和注射。治療期間,全部大鼠都用常規(guī)飼料喂養(yǎng),自由飲水。實(shí)驗(yàn)動物于治療12 w末空腹12 h,然后從心臟采血制備血漿和血清標(biāo)本-70℃保存待測,斷髓處死動物,摘取右側(cè)腎臟,去包膜后用濾紙吸干水分稱重,將右腎質(zhì)量與體質(zhì)量之比作為腎臟肥大指數(shù)(KW/BW)。左側(cè)腎臟取其皮質(zhì)液氮保存用于鈉鉀-A TP酶活性測定。

1.2.2 生化及放免檢測

血糖采用快速血糖測定儀測定,TG、TC、SOD和MDA的檢測嚴(yán)格按照說明書操作,采用751分光光度計(jì),FINS測定采用放射免疫分析法。

1.2.3 腎皮質(zhì)鈉鉀-ATP酶活性測定

取每只實(shí)驗(yàn)大鼠0.3 g腎皮質(zhì)置于玻璃皿中,加入9倍體積的冷生理鹽水,在冰浴條件下剪碎并勻漿處理,取10%勻漿4000 rpm離心15min,取上清液用定磷法按試劑盒說明書測定,樣品中總蛋白含量用考馬斯亮蘭法測定。鈉鉀-ATP酶活性以每毫克腎皮質(zhì)組織總蛋白中鈉鉀-ATP酶每小時(shí)分解ATP產(chǎn)生的無機(jī)磷(Pi)的量表示(μ mol?mg-1protein?hr-1)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS10.0軟件行雙側(cè)t檢驗(yàn)和單因素方差分析,計(jì)量結(jié)果均以±sd表示,以P＜0.05作為統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠的一般癥狀和體征變化

與正常對照組大鼠比較,建立的T2DM模型大鼠體重明顯增加,并出現(xiàn)腹型肥胖和多飲,多食,多尿的癥狀,毛發(fā)色澤黯淡,精神萎靡,活動減少,隨著病程延長,除大鼠體重呈下降趨勢外,其它癥狀逐漸加重;與模型對照組大鼠比較,Bre聯(lián)合纈沙坦治療12 w后,上述癥狀體征得到明顯改善。

2.2 大鼠血糖血脂和腎臟肥大指數(shù)的變化

表1可見,與正常對照組比較,糖尿病模型對照組大鼠FBG、TC、TG水平顯著升高(P＜0.01),KW/BW 顯著增大(P＜0.05);與模型對照組比較,治療組大鼠12 w后,FBG、TC、TG水平顯著下降(P＜0.01),KW/BW 顯著降低(P＜0.05)。

表1 實(shí)驗(yàn)大鼠血清FBG、TC、TG和腎臟肥大指數(shù)的變化(d,n=10)

表1 實(shí)驗(yàn)大鼠血清FBG、TC、TG和腎臟肥大指數(shù)的變化(d,n=10)

注：aP ＜0.05,bP＜0.01,與A組比較

組別 FBG(mmol?L-1)TG(mmol?L-1)TC(mmol?L-1)KW/BW(×10-3)A 6.07±0.44 1.14±0.23 1.95±0.37 3.14±0.26 B 16.35±3.42b 3.38±0.96b 3.52±0.67b 4.62±0.43a C 11.36±0.88b 1.75±0.42b 2.54±0.46b 3.68±0.33a

2.3 藥物治療對實(shí)驗(yàn)大鼠血漿SOD、M DA水平的影響

表2可見,與正常對照組比較,糖尿病模型對照組大鼠血漿SOD水平顯著降低(P＜0.01),MDA水平顯著升高(P＜0.01);與模型對照組比較,治療組12 w后,大鼠血漿SOD水平顯著升高(P＜0.01),M DA水平顯著降低(P＜0.01)?！纒d,n=10)

表2 實(shí)驗(yàn)大鼠血漿SOD與MDA水平的變化(）

表2 實(shí)驗(yàn)大鼠血漿SOD與MDA水平的變化(）

注：aP ＜0.01,與 A 組比較

組別 SOD(U?ml-1) MDA(mmol?L-1)A 120.28±23.34 4.64±1.16 B 85.53±16.82a 18.66±4.48a C 107.61±18.65a 8.93±2.24a

2.4 實(shí)驗(yàn)大鼠血清胰島素和胰島素敏感指數(shù)的變化

表3可見,與正常對照組比較,糖尿病模型對照組大鼠血清FINS水平顯著升高(P＜0.01),ISI顯著降低(P＜0.05);與糖尿病模型對照組比較,藥物治療12 w后,大鼠血清FINS水平顯著降低(P＜0.05),ISI顯著升高(P＜0.05)。

表3 藥物治療對實(shí)驗(yàn)大鼠血清FINS、ISI和腎皮質(zhì)鈉鉀-ATP酶活性的影響(d,n=10)

表3 藥物治療對實(shí)驗(yàn)大鼠血清FINS、ISI和腎皮質(zhì)鈉鉀-ATP酶活性的影響(d,n=10)

注：aP ＜0.05,bP＜0.01,與A組比較

組別 FINS(mIU?L-1) ISI 鈉泵活性(μ mol Pi?mg-1 ?h-1)A 15.75±4.12 -4.16±0.22 2.68±0.54 B 22.41±5.45b -5.81±0.43a 1.72±0.21b C 18.56±4.82a -4.71±0.35a 2.28±0.34b

2.5 藥物治療對糖尿病大鼠腎皮質(zhì)鈉泵活性的影響

與正常對照組比較,12 w后模型對照組大鼠腎皮質(zhì)鈉鉀-ATP酶活性顯著降低(P＜0.01);與糖尿病模型對照組比較,治療組12 w后,腎皮質(zhì)鈉鉀-ATP酶活性顯著升高(P＜0.01),見表3。

3 討論

糖尿病是由于胰島素或其受體缺乏引起的以高血糖為特征的慢性代謝性疾病。T2DM主要是通過長期的高血糖高血脂對循環(huán)系統(tǒng)造成損傷,誘發(fā)機(jī)體細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗,血脂異常還可能是糖尿病腎病的重要危險(xiǎn)因素之一。研究表明,燈盞花素具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫、降低血脂,改善腎臟微循環(huán)等作用[3]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,糖尿病大鼠經(jīng)12 w治療后,FBG、TC和TG水平顯著降低,胰島素敏感性顯著升高,多飲多食多尿和精神活動下降的癥狀得到顯著改善,說明該組藥物對T2DM模型大鼠具有明顯療效。

據(jù)報(bào)道,高血糖可與SOD活性中心的賴氨酸結(jié)合,產(chǎn)生糖化反應(yīng),使SOD活性下降,抑制自由基的清除[9]。氧自由基通過攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸,引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用,并因此形成脂質(zhì)過氧化物,如MDA、酮基、羥基等,進(jìn)而引起細(xì)胞代謝及功能障礙。因此,本實(shí)驗(yàn)通過測定大鼠血漿SOD和MDA水平,了解動物體內(nèi)氧化與抗氧化能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示疾病模型大鼠氧化能力增強(qiáng),而抗氧化能力減弱,同時(shí)也表明Bre聯(lián)合纈沙坦治療能夠提高糖尿病大鼠機(jī)體的抗氧化能力,這與既往文獻(xiàn)報(bào)道Bre能夠清除氧自由基,提高機(jī)體抗氧化能力一致。而且,這兩種藥物聯(lián)合使用,比本實(shí)驗(yàn)以往單純使用Bre對T2DM的降糖降脂效果更顯著。

纈沙坦是血管緊張素Ⅱ受體(AT1)的特異拮抗劑,可以有效抑制血管收縮和醛固酮的釋放,同時(shí)降低腎皮質(zhì)轉(zhuǎn)化生長因子(TGFβ1)及其Ⅱ型受體mRNA 的表達(dá),擴(kuò)張腎臟血管,改善局部血液循環(huán);還能降低血肌苷和血尿素氮水平,減輕腎臟肥大,抑制細(xì)胞外基質(zhì)積聚,延緩DN的發(fā)展[10]。實(shí)驗(yàn)通過檢測腎臟肥大指數(shù)和腎皮質(zhì)鈉鉀-ATP酶的活性,了解藥物對腎臟結(jié)構(gòu)和功能的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示糖尿病大鼠12 w時(shí),腎臟結(jié)構(gòu)和功能已經(jīng)發(fā)生顯著改變,治療組的結(jié)構(gòu)表明該方案對T2DM大鼠腎臟形態(tài)結(jié)構(gòu),特別是功能蛋白具有顯著的保護(hù)作用。

總之,燈盞花素聯(lián)合纈沙坦對T2DM大鼠腎臟結(jié)構(gòu)和功能具有顯著保護(hù)作用,其機(jī)制可能主要是通過降低糖尿病大鼠血糖血脂,減少組織炎癥反應(yīng),提高動物機(jī)體抗氧化能力和擴(kuò)張血管,降低血壓,改善腎臟組織血液循環(huán)有關(guān)。

1 Yang W,Lu J,Weng J,et al.Prevalence of Diabetes among Men and Women in China[J].N Engl J M ed,2010,362(12)：1090-1101.

2 王文娟.糖尿病及常見并發(fā)癥[J].新醫(yī)學(xué),2004,35(1)：8-11.

3 黃愛玲.黃酮類化合物藥理作用研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào),2007,13(10)：71-72.

4 Chenval L,Doucet A.M easurement of Na+-K+-AT Pase-mediated rubidium influx in single segments of rat nephron[J].Am J Phy siol,1990,259(1)：F111-121.

5 劉紅,羅蕾,高原.2型糖尿病大鼠近球小管 Na+,K+-AT Pase活性變化[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2006,28(20)：2062-2064.

6 李光偉,潘孝仁,Lillioja,等.檢測人群胰島素敏感性的一項(xiàng)新指數(shù)[J].中華內(nèi)科雜志,1993,32(10)：656-660.

7 趙珉,吳永貴,林輝,等.燈盞花素對糖尿病大鼠肝腎組織氧化應(yīng)激的影響[J].中國病理生理雜志,2005,21(4)：802-807.

8 施輝,羅鑭,張定武,等.纈沙坦對糖尿病大鼠一氧化氮及腎臟轉(zhuǎn)化生長因子β1水平的影響[J].南通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2007,27(4)：240-242.

9 楊蘭澤,高靜,付建斌,等.NIDDM患者血清Lpo SOD NO和GHb檢測及其臨床意義[J].中國慢性病預(yù)防與控制,2000,8(3)：137-138.

10 郭志新,邱明才.氯沙坦對糖尿病大鼠腎臟轉(zhuǎn)化生長因子p及其Ⅱ型受體表達(dá)的影響及機(jī)制[J].中國糖尿病雜志,2003,11(6)：421-422.