張羅紅 彭艷 徐燕

(1.四川省食品藥品檢驗(yàn)所,四川 成都 610097;2.南京醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,江蘇 南京 210029)

紅景天苷(Salidroside),化學(xué)名為“對羥苯乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷(p-hydroxyphenethyl-β-D-glucopyranoside)” ,白色晶體性粉末,是紅景天的主要藥理活性成分。紅景天苷具有抗缺氧、抗疲勞、抗輻射、抗衰老及增強(qiáng)腦力、體力機(jī)能等方面的特殊功效[1-2]。藥理實(shí)驗(yàn)表明,紅景天提取物紅景天苷有良好的心血管系統(tǒng)作用[3-5],在腦缺血、缺氧,神經(jīng)元細(xì)胞凋亡方面均有一定的保護(hù)作用[6-8]。臨床上紅景天苷主要用于治療心腦血管疾病。目前有關(guān)紅景天中紅景天苷含量測定的報(bào)道較多[9-15],但未見對原料藥中紅景天苷及3個(gè)有關(guān)物質(zhì)(其分離與結(jié)構(gòu)鑒定同時(shí)測定的報(bào)道。本研究采用RP-HPLC法同時(shí)測定紅景天苷原料藥中紅景天苷及其有關(guān)物質(zhì)的含量,結(jié)果該方法簡便、靈敏。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

LC-10A型高效液相色譜儀系列(日本島津)。紅景天苷對照品(含量測定用,批號：110818-200404,中國藥品生物制品檢定所);淫羊藿次苷 D2、4-乙?；椒?β-D-葡萄糖苷、云杉素對照品(自制,從紅景天苷原料藥中分離純化得到,純度均大于99%);紅景天苷原料藥(批號：060601、060603、060605、060607、060609,成都恒基醫(yī)藥科技有限公司);甲醇為色譜純;水為純化水。

1.2 含量測定方法

1.2.1 含量測定色譜條件 色譜柱：Shim-pack C18柱(5 μ m,4.6×150mm,Shimadzu);流動(dòng)相：甲醇/水(15/85,v/v);檢測波長為275nm;進(jìn)樣量為 20μ L;流速為1.0mL?min-1;柱溫為25℃0。

1.2.2 溶液的配制

1.2.2.1 對照品儲備液配制分別精密稱取紅景天苷、淫羊藿次苷D2(Imp 1)、4-乙?；椒?β-D-葡萄糖苷(Imp 2)和云杉素(Imp 3)對照品適量,加流動(dòng)相制成 1.0、0.2、0.1、0.1mg?mL-1的對照品儲備液。

1.2.2.2 對照品溶液配制 精密量取各對照品儲備液適量,加流動(dòng)相稀釋分別制成 30.0、125.0、250.0、500.0、750.0、1000.0μ g?mL-1的紅景天苷對照品溶液;1.0、6.0、12.0、18.0、24.0、30.0μ g?mL-1的 Imp 1 對照品溶液;0.3、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0μ g?ml-1的 Imp 2 對照品溶液;0.1、0.6、1.2、1.8、2.4、3.0μ g?mL-1的Imp 3對照品溶液。

1.2.2.3 供試品溶液配制取紅景天苷原料藥適量,精密稱定,加流動(dòng)相制成1mg?mL-1的供試品溶液。

1.2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱的理論塔板數(shù)(N) 取紅景天苷對照品適量,注入液相色譜儀,按“1.2.1”色譜條件測定。

分離度(R)取供試品溶液適量,注入液相色譜儀,按“1.2.1”色譜條件測定。

1.2.4 檢測限與定量限試驗(yàn) 在“1.2.1”色譜條件下,按信噪比(S/N)為3對檢測限進(jìn)行測定,按信噪比為10對定量限進(jìn)行檢測。

1.2.5 線性關(guān)系測定 將上述系列對照品溶液按“1.2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣,分別測定其峰面積,以濃度(mg?mL-1)對峰面積進(jìn)行線性回歸。

1.2.6 日內(nèi)與日間精密度試驗(yàn) 分別取紅景天苷對照品溶液(250μ g?mL-1)、Imp 1 對照品溶液(30μ g?ml-1)、Imp 2 對照品溶液(4μ g?mL-1)和Imp 3對照品溶液(3μ g?mL-1),在“1.2.1”色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣10次,以峰面積(Area)與保留時(shí)間(tR)考察其日內(nèi)精密度,連續(xù)測定3d,考察日間精密度。

1.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批供試品溶液,每隔2h進(jìn)樣、測定一次,計(jì)算紅景天苷、Imp 1、Imp 2和 Imp 3峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD%)。

1.2.8 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 取同一批號樣品6份,按“1.2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行測定,分別用峰面積計(jì)算紅景天苷、Imp 1、Imp 2和Imp 3含量。

1.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的紅景天苷原料藥[紅景天苷(970mg?g-1),Imp 1(15mg?g-1),Imp 2(4mg?g-1),Imp 3(11mg? g-1)]9份,每份約100mg,精密稱定,分別加紅景天苷、Imp 1、Imp 2及Imp 3的對照品(按紅景天苷原料藥實(shí)際各成分含量的80%、100%、120%),按供試品溶液的制備方法進(jìn)行制備,測定峰面積,計(jì)算回收率以及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.10 樣品的測定按“供試品溶液制備”方法制備5批(每批各3份)紅景天苷原料藥供試溶液品,分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液,按上述色譜條件測定,以外標(biāo)法計(jì)算含量。

2 結(jié)果

2.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)結(jié)果

色譜柱的理論塔板數(shù)(N) 試驗(yàn)結(jié)果紅景天苷對照品tR=(11.85+11.84+11.85)/3=11.85,N=(5268+5231+5203)/3=5234(n=3)。

圖1 淫羊藿次苷D2(A)、4-乙?；椒?β-D-葡萄糖苷(B)、云杉素(C)、紅景天苷(D)對照品溶液和紅景天苷原料藥(E)的HPLC圖

紅景天苷、Imp 1、Imp 2和Imp 3之間的分離度均大于1.5(圖1)。

2.2 檢測限與定量限試驗(yàn)

結(jié)果表明：紅景天苷、Imp 1、Imp 2和Imp 3的檢測限依次為 100、50、10、10ng ?ml-1,定量限依次為 10000、300、100、80ng?mL-1。

2.3 線性關(guān)系測定結(jié)果

以峰面積為縱坐標(biāo),藥物濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析,得回歸方程與濃度的線性關(guān)系結(jié)果見表1。結(jié)果表明：紅景天苷、Imp 1、Imp 2、Imp 3與峰面積的線性關(guān)系良好。

表1 紅景天苷及有關(guān)物質(zhì)的線性范圍測定結(jié)果(n=6)

表2 紅景天苷及有關(guān)物質(zhì)的日內(nèi)與日間精密度測定結(jié)果

2.4 日內(nèi)與日間精密度試驗(yàn)

以峰面積(Area)與保留時(shí)間(tR)考察其日內(nèi)精密度,連續(xù)測定3d,考察日間精密度。其結(jié)果如表2所示,RSD均小于2%,精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

取同一批供試品溶液,每隔2h進(jìn)樣、測定一次,計(jì)算得到紅景天苷、Imp 1、Imp 2和Imp 3峰面積的 RSD分別為0.86%、1.12%、1.26%、1.14%。試驗(yàn)表明供試品溶液至少在10h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

取同一批號樣品6份,進(jìn)行測定,分別用峰面積計(jì)算紅景天苷、Imp 1、Imp 2和Imp 3含量,其平均含量分別為 970mg?g-1、15mg?g-1、4mg?g-1、11mg?g-1,RSD 分別為 0.47%、0.88%、1.01%、0.85%。試驗(yàn)表明本法重現(xiàn)性較好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

用峰面積計(jì)算含量并進(jìn)行分析,結(jié)果見表3。試驗(yàn)表明本法測定紅景天苷原料藥中的紅景天苷及其有關(guān)物質(zhì)含量準(zhǔn)確度高。

表3 紅景天苷及有關(guān)物質(zhì)的回收率測定結(jié)果(n=3)

2.8 樣品的測定

用峰面積計(jì)算含量,其結(jié)果見表4。

表4 紅景天苷及有關(guān)物質(zhì)的含量測定結(jié)果(n=3)

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 在多成分含量同時(shí)測定中,檢測波長的選擇非常關(guān)鍵。對紅景天苷、淫羊藿次苷D2(Imp 1)、4-乙酰基苯酚-β-D-葡萄糖苷(Imp 2)和云杉素(Imp 3)對照品溶液進(jìn)行全波長掃描,其最大吸收峰波長分別為 275、270,280nm,和265nm,在上述色譜條件下,分 別于 230、254、275、295nm 和315nm處對供試品溶液進(jìn)行分析,結(jié)果275nm處所得的HPLC圖譜上各成分峰分離效果較好,且3個(gè)有關(guān)物質(zhì)峰響應(yīng)值(或峰面積)達(dá)到最高。故選擇275nm為檢測波長。

3.2 流動(dòng)相比例的選擇 分別采用甲醇/水(12/88,v/v)、甲醇/水(13/87,v/v)、甲醇/水(15/85,v/v)作為流動(dòng)相,進(jìn)行測定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相比例的變化對分析時(shí)間影響較大。在不影響所有目標(biāo)分析物之間分離度的情況下,使用后一種比例的流動(dòng)相,整個(gè)分析時(shí)間比前兩者縮短近四分之一。故最后確定流動(dòng)相甲醇/水的比例為15/85。

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