邵振中，賈曉斌，陳彥，封亮，施峰（.江蘇省中醫(yī)藥研究院中藥新型給藥系統(tǒng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥口服釋藥系統(tǒng)重點(diǎn)研究室，南京市 20028；2.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，鎮(zhèn)江市 2203）

中藥復(fù)方三草方（SCF）是江蘇省中醫(yī)藥研究院治療非小細(xì)胞性肺癌的臨床驗(yàn)方，由夏枯草、白花蛇舌草、仙鶴草等藥味組成，具有滋補(bǔ)肝腎、清熱利濕、散結(jié)抗癌之功效。在臨床應(yīng)用中該驗(yàn)方被證明不僅可以改善癥狀，提高患者的生存質(zhì)量，而且可以減少復(fù)發(fā)，延長(zhǎng)患者的生存期。本研究制備了SCF的水煎液及不同極性部位提取物，以SPC-A-1肺腺癌細(xì)胞株為模型，篩選出最有效抗癌極性部位，并明確提出了不同極性間的最佳配伍方案，為制備療效更好的該復(fù)方制劑作準(zhǔn)備，并為進(jìn)一步闡明其抗肺癌的物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

MK3型酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司）；BS203型倒置顯微鏡（日本Coic公司）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo公司）；真空恒溫干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2 試藥

夏枯草、白花蛇舌草、仙鶴草等藥材購于安徽亳州滕王藥業(yè)有限公司，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院吳德康教授鑒定均為真品；胰蛋白酶、RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）；順鉑（DDP，南京制藥廠有限公司，批號(hào)：20071104）；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT，南京生興生物有限公司）。

1.3 細(xì)胞

SPC-A-1細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫。

2 方法

2.1 SCF的提取與制備

2.1.1 水煎液的提?。喊刺幏奖壤Q取該復(fù)方，用10倍量的沸水提取2次，每次2 h，提取液經(jīng)40目篩過濾后混合，定容至含生藥量100 mg·mL-1。實(shí)驗(yàn)前用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，給藥時(shí)用PBS溶液稀釋至所需濃度。

2.1.2 各極性部位的提?。喊刺幏奖壤Q取該復(fù)方，依次用10倍量的95%、60%、30%乙醇溶液和水回流提取2次，每次1 h，濾過，回收乙醇，濃縮液真空干燥（溫度60℃），95%和60%醇提部位用一定量含5%乙醇的PBS溶液溶解（有機(jī)相終濃度不超過0.5%），30%醇提部位和水提部位用一定量的PBS溶液溶解。這4個(gè)極性部位提取物均制成生藥含量為100 mg·mL-1的SCF各極性提取液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，實(shí)驗(yàn)時(shí)用PBS溶液稀釋至所需的藥物濃度。

2.2 SCF水煎液及各極性部位對(duì)SPC-A-1細(xì)胞增殖活性的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞使其脫壁，用10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液重懸成單細(xì)胞懸液，以每孔2.5×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔培養(yǎng)液100 μL。將培養(yǎng)板移入細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸棄孔內(nèi)原培養(yǎng)液，加入不含胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液90 μL，再加入10 μL SCF水煎液及各極性提取部位不同濃度的PBS溶液，經(jīng)初步的預(yù)實(shí)驗(yàn)，生藥濃度均設(shè)置為10.0、5.0、2.0、0.4、0.08 mg·mL-1梯度。然后移入細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)36 h，每個(gè)藥物濃度設(shè)6個(gè)平行復(fù)孔，設(shè)上下本底對(duì)照孔，另設(shè)陽性對(duì)照組（DDP，濃度為25 mg·L-1）和PBS空白對(duì)照組。36 h后，每孔加入5 mg·mL-1MTT 溶液10 μL，5%CO2、37℃繼續(xù)孵育4 h后終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)上清液，每孔加DMSO 100 μL，在微量振蕩儀振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度（A）值，檢測(cè)波長(zhǎng)為550 nm，參比波長(zhǎng)為690 nm。藥物半數(shù)抑制濃度（IC50）用SPSS 10.0軟件進(jìn)行計(jì)算。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。按下式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。

細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%）＝（1－用藥組平均A值/空白對(duì)照組平均A值）×100%

2.3 SCF各極性部位配伍后對(duì)SPC-A-1細(xì)胞增殖活性的影響

采用60%醇提部位與其它1個(gè)或多極性部位按1∶1等生藥量進(jìn)行配伍。60%醇提部位與95%醇提部位的配伍和60%醇提部位、95%醇提部位再與其它1個(gè)或2個(gè)極性部位配伍，其生藥濃度均設(shè)置為1.0、0.4、0.2、0.08、0.016 mg·mL-1梯度；60%醇提取部位與30%醇提部位的配伍、60%醇提部位與30%醇提及水提2個(gè)部位的配伍、60%醇提部位與水提部位的配伍，其生藥濃度均設(shè)置為2.0、1.0、0.4、0.2、0.08 mg·mL-1梯度。實(shí)驗(yàn)操作同“2.2”項(xiàng)下方法。

2.4 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)

經(jīng)各組藥物處理的SPC-A-1細(xì)胞直接置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 SCF水煎液及各極性部位對(duì)SPC-A-1細(xì)胞的增殖抑制作用

SCF60%醇提部位、95%醇提部位及水煎液對(duì)SPC-A-1細(xì)胞均有顯著的抑制作用，SCF水煎液和各極性部位對(duì)SPC-A-1細(xì)胞的抑制作用都有劑量依賴性；SCF60%醇提部位對(duì)SPC-A-1細(xì)胞的IC50最低，與其它各組藥物均有顯著性差異（P＜0.05），說明60%醇提部位對(duì)SPC-A-1細(xì)胞的抑制作用最好，其次為SCF水煎液。故采用60%醇提部位與其它1個(gè)或多極性部位按1∶1等生藥量進(jìn)行配伍。復(fù)方水煎液和各極性部位對(duì)SPC-A-1細(xì)胞增殖作用的影響見圖1；各組藥物對(duì)SPC-A-1細(xì)胞的IC50見圖2。

圖1 復(fù)方水煎液和各極性部位對(duì)SPC-A-1細(xì)胞增殖作用的影響Fig 1 Effect of various polarity fractions of SCF and compound decoction with different concentration on proliferation of SPC-A-1 cells

圖2 各組藥物對(duì)SPC-A-1細(xì)胞的IC50與60%醇提部位比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Fig 2 IC50of various drugs for SPC-A-1 cellsvs.60%ethanol extract：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

3.2 SCF各極性部位合并后對(duì)SPC-A-1細(xì)胞的增殖抑制作用

SCF 60%醇提部位與其它1個(gè)或多個(gè)醇提部位按1∶1等生藥量配伍后，對(duì)SPC-A-1細(xì)胞均有顯著的抑制作用，并且呈劑量依賴關(guān)系；在60%醇提部位與其它1個(gè)或多個(gè)極性部位的配伍中，它們的IC50與60%醇提部位的IC50比較呈顯著性降低（P＜0.01）。這說明95%、30%醇提和水提部位對(duì)60%醇提部位均有一定的協(xié)同抑瘤作用。60%醇提部位與95%醇提部位配伍后，或60%與95%醇提部位再加上1個(gè)或者2個(gè)其它部位配伍后，IC50均無顯著性變化（P＞0.05）；60%醇提部位與30%醇提部位和水提部位之間的配伍，它們的IC50也無顯著性變化（P＞0.05）；而后三者與60%醇提部位與95%醇提部位的配伍比較，有顯著性差異。這說明用60%與95%醇提部位配伍后就可以達(dá)到預(yù)期的要求。各極性部位配伍后對(duì)SPC-A-1細(xì)胞的IC50見圖3。

3.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

為后續(xù)研究SCF各提取部位對(duì)腫瘤細(xì)胞作用的機(jī)制，采用倒置顯微鏡觀察SPC-A-1細(xì)胞生長(zhǎng)情況。結(jié)果表明，經(jīng)SCF各提取物處理36 h后的SPC-A-1細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，并出現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞典型的凋亡形態(tài)變化現(xiàn)象，細(xì)胞浮懸于培養(yǎng)液中，細(xì)胞體積縮小、變圓，核顏色加深，細(xì)胞透明度和黏附力降低；而PBS對(duì)照組SPC-A-1細(xì)胞生長(zhǎng)良好，貼壁生長(zhǎng)，體積大，細(xì)胞核以圓形或橢圓形為主。這說明SCF各提取物有可能是通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡來抑制SPC-A-1細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的。各組藥物作用SPC-A-1細(xì)胞36 h后倒置顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化見圖4。

圖3 各極性部位配伍后對(duì)SPC-A-1細(xì)胞的IC50與60%醇提部位比較：＊P＜0.01；與60%和95%醇提部位配伍比較：#P＜0.05，##P＜0.01Fig 3 IC50of various polarity fractions of SCF after mixing for SPC-A-1 cellsvs.60%ethanol extract：＊P＜0.01；vs.60%ethanol extract combined with 95%ethanol extract：#P＜0.05，##P＜0.01

圖4 各組藥物作用SPC-A-1細(xì)胞36 h后倒置顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化A.PBS對(duì)照組；B.60%醇提部位（5 mg·mL-1）；C.復(fù)方水煎液（10 mg·mL-1）Fig 4 Morphological changes of SPC-A-1 cells treated with various drugs for 36 h under inverted microscopeA.PBS control group；B.60%ethanol extract（5 mg·mL-1）；C.compound decoction（10 mg·mL-1）

4 討論

體外抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性的研究說明，SCF60%和95%醇提部位的合并是最為合適的，這為制備療效更好的該復(fù)方制劑提供了一些基礎(chǔ)。SCF60%醇提部位與其它極性部位合并后，IC50均有顯著降低，說明該復(fù)方有效組分之間在藥理作用上具有協(xié)同作用，這從一個(gè)方面驗(yàn)證了中藥復(fù)方的藥理作用是多種有效組分共同作用的假說[1，2]，也符合筆者所提出的關(guān)于物質(zhì)基礎(chǔ)“三個(gè)層次多維結(jié)構(gòu)”假說中的一維結(jié)構(gòu)：由多組分構(gòu)成的整體（即中藥復(fù)方的物質(zhì)基礎(chǔ)）其各組分間存在配伍配比關(guān)系[3]。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，夏枯草、白花蛇舌草中的三萜類化合物——熊果酸與齊墩果酸[3，4]的含量較高，且藥理實(shí)驗(yàn)也證明這2種三萜類物質(zhì)均具有較好的直接抑制腫瘤細(xì)胞的作用[5～7]。經(jīng)初步化學(xué)試驗(yàn)表明，SCF水煎液中含有三萜類、黃酮類、酚類和糖類物質(zhì)；SCF60%與95%醇提部位主要含有三萜類、黃酮類和酚類化合物；而SCF30%醇提與水提部位主要含有黃酮類和糖類化合物。且本研究結(jié)果也證實(shí)，SCF水煎液、60%和95%醇提部位對(duì)人肺腺癌SPC-A-1細(xì)胞的IC50顯著低于SCF30%醇提和水提部位，由此推斷SCF中的三萜類有機(jī)酸類化合物可能是直接抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性的主要有效成分。

本研究采用體外腫瘤細(xì)胞模型進(jìn)行篩選，研究了SCF中各極性部位及其合并后對(duì)腫瘤細(xì)胞的直接殺傷作用，筆者準(zhǔn)備進(jìn)一步研究促進(jìn)機(jī)體免疫反應(yīng)的間接抑瘤作用和功能組分對(duì)有效組分的作用，為劑型優(yōu)化作進(jìn)一步準(zhǔn)備，并闡明SCF抗肺癌的物質(zhì)基礎(chǔ)，為創(chuàng)制抗肺癌現(xiàn)代復(fù)方中藥提供科學(xué)依據(jù)。

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