李晟磊,趙志華,陳奎生,張 嵐,高冬玲,張?jiān)茲h,張 蕾(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院,鄭州 450052)

KISS-1是一種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因[1],其表達(dá)缺失或降低與腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及血管生成有關(guān),但其具體機(jī)制尚不完全清楚。我們前期研究發(fā)現(xiàn),在食管鱗癌組織中存在 KISS-1表達(dá)缺失,且 KISS-1和MMP-2的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。2008年 4～7月,我們將攜帶 KISS-1基因的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人食管鱗癌細(xì)胞 EC-9706細(xì)胞,觀察其對(duì) MMP-2表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 pcDNA 3.1-KISS-1質(zhì)粒,EC-9706,RTPCR一步法試劑盒,凱基全蛋白提取試劑盒(KGP-2-50),SP免疫組化檢測(cè)試劑盒,LipofectamineTM2000,KISS-1兔抗人多克隆抗體,MMP-2羊抗人多克隆抗體,KISS-1、MMP-2引物由北京賽百盛生物工程公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與基因轉(zhuǎn)染 EC-9706細(xì)胞在含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和 100μg/ml鏈霉素的完全培養(yǎng)基中,37℃、5%CO2培養(yǎng),以 1×105～2×105/孔接種于 24孔板上,待細(xì)胞長(zhǎng)至 80%～90%融合時(shí)分為 A、B、C組。A、B組按試劑盒要求分別加入 pcDNA3.1-KISS-1質(zhì)粒、pcDNA3.1空質(zhì)?；靹?置 37℃孵箱培養(yǎng),轉(zhuǎn)染 4～6 h換液,加入完全培養(yǎng)液終止轉(zhuǎn)染。于轉(zhuǎn)染后 48 h加入終濃度為600 μg/ml的 G418,連用 2周。挑取肉眼可辨的單克隆細(xì)胞,以 G418終濃度為 400μg/ml繼續(xù)培養(yǎng),以獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞。C組不處理。

1.2.2 KISS-1、MMP-2蛋白檢測(cè)方法 采用 Western blot法。按總蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總蛋白,Bradford法檢測(cè)蛋白質(zhì)含量。蛋白經(jīng) SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜,用含 1%脫脂奶粉的TBST封閉 30 min。一抗于 4℃孵育過(guò)夜,TBST洗滌3次 ×10 min；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗于室溫孵育 2 h,TBST洗滌 3次 ×10 min。膜與化學(xué)發(fā)光底物孵育 5 min,經(jīng) X線片曝光、顯影、定影。顯色結(jié)果用Total Lab2.0軟件進(jìn)行灰度分析,以 KISS-1、MMP-2與 β-actin的灰度比值表示其蛋白表達(dá)量。

1.2.3 KISS-1、MMP-2 mRNA檢測(cè)方法 采用 RTPCR一步法。RNA提取過(guò)程按 Trizol RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,預(yù)期擴(kuò)增片段大小分別為 191、318、480 bp。 RT-PCR反應(yīng)條件:50℃ 30 min,94℃2 min,94℃ 40 s,KISS-1為 48℃ 30 s(MMP-2為 60℃30 s),72℃ 1 min,共 30個(gè)循環(huán)；72℃延伸 10 min。取 5μl用 1.5%瓊脂糖凝膠電泳,在凝膠成像儀上成像并進(jìn)行灰度分析。以 KISS-1、MMP-2 mRNA與 β-actin的灰度比值表示其 mRNA表達(dá)量。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS13.0軟件。各組間比較采用 F分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組 KISS-1、MMP-2蛋白表達(dá)比較 見(jiàn)表1。

表1 各組 KISS-1、MM P-2蛋白表達(dá)比較(±s)

表1 各組 KISS-1、MM P-2蛋白表達(dá)比較(±s)

注:與 B、C組比較,*P均 ＜0.05

組別 KISS-1 MMP-2 A組 1.143±0.118* 0.737±0.115*B組 0.752±0.113 0.985±0.178 C組 0.761±0.127 1.038±0.233

2.2 各組 KISS-1、MMP-2 mRNA的表達(dá)比較 見(jiàn)表2。

表2 各組 KISS-1、MMP-2 mRNA表達(dá)比較(±s)

表2 各組 KISS-1、MMP-2 mRNA表達(dá)比較(±s)

注:與 B、C組比較,*P均 ＜0.05

組別 KISS-1 mRNA MMP-2 mRNA A組 0.892±0.166* 0.685±0.104*B組 0.679±0.141 0.808±0.057 C組 0.686±0.148 0.815±0.073

3 討論

KISS基因定位于染色體 1q32q41區(qū),可以編碼由 145個(gè)氨基酸組成親水性蛋白。其羧基末端(61～121)的 54個(gè)氨基酸是人孤兒 G蛋白偶聯(lián)受體(hOT7T175)的配體,被命名為轉(zhuǎn)移抑素,與其受體結(jié)合可在人類(lèi)多種腫瘤中發(fā)揮抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用[2,3],但具體機(jī)制尚不明確。

腫瘤細(xì)胞需產(chǎn)生和誘導(dǎo)某些蛋白酶類(lèi),降解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)及基底膜成分,破壞基底膜的完整性,才能穿越組織屏障向周?chē)?rùn)和轉(zhuǎn)移[4]。其MMP-2是一種能降解Ⅳ型膠原等多種 ECM成分的蛋白水解酶,其以酶原的形式分泌到細(xì)胞外,經(jīng)活化才有活性。MMP-2表達(dá)水平與腫瘤惡性度密切相關(guān),故在腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[5]。

食管癌患者早期出現(xiàn)侵襲和轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特性嚴(yán)重影響了患者的生存率。目前,有關(guān) KISS-1基因在食管癌中表達(dá)情況的研究較少,且局限于組織水平[6]。本研究在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,構(gòu)建 KISS-1真核表達(dá)載體,并將其轉(zhuǎn)染 EC-9706,采用 Western blot、RT-PCR技術(shù)首先驗(yàn)證 KISS-1基因轉(zhuǎn)染成功,并檢測(cè)了 MMP-2蛋白及 mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染 KISS-1后 EC-9706細(xì)胞中 KISS-1蛋白及mRNA的表達(dá)顯著增加(P均 ＜0.05),而 MMP-2蛋白及 mRNA的表達(dá)水平卻明顯降低(P均 ＜0.05),提示 KISS-1通過(guò)降低 MMP-2的表達(dá)可能是其抑制食管癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制之一。有資料報(bào)道,KISS-1還可能通過(guò) MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、Rac/Cdc42途徑及PKC/PLC、Ca2+途徑調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡及抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。因此,需對(duì) KISS-1基因進(jìn)行深入、廣泛的研究。

[1]Lee JH,Miele ME,Hicks DJ,et al.KISS-1,a novel human malignant melanoma metastasis suppressor gene[J].Natl Cancer Inst,1996,88(23):1731-1737.

[2]Zheng HC,Yu AM,Xin Y.Aberrant expression of Kiss-1 and matrix metalloproteinase-9 are closely linked to lymph node metastasis of gastric cancer[J].Chin Med Sci J,2008,23(1):63-64.

[3]Katagiri F,Nagai K,Kida A,et al.Clinical significance of plasma metastin level in pancreatic cancer patients[J].Oncol Rep,2009,21(3):815-819.

[4]Poincloux R,Lizárraga F,Chavrier P.Matrix invasion by tumour cells:a focus on MT1-MMP trafficking to invadopodia[J].J Cell Sci,2009,122(Pt17):3015-3024.

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[6]Ikeguchi M,Yamaguchi K,Kaibara N.Clinical significance of the loss of KISS-1 and orphan G-protein-coupled receptor(hOT7T175)gene expression in esophageal squamous cell carcinoma[J].Clin Cancer Res,2004,10(4):1379-1383.