邵翠杰，許洪升，陳忠平

(1徐州醫(yī)學(xué)院麻醉學(xué)院，江蘇徐州221002;2徐州市中心醫(yī)院;3中山大學(xué)腫瘤防治中心)

目前膠質(zhì)瘤化療的臨床有效率較低，除血腦屏障限制藥物進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)外，腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物耐藥是重要原因［1］。丙戊酸(VPA)是膠質(zhì)瘤術(shù)后預(yù)防癲癇的常用藥物，我們前期研究發(fā)現(xiàn)，其在抗癲癇的同時(shí)能夠增強(qiáng)化療藥物殺傷腫瘤的效果。2008年9～12月，我們將VPA分別與順鉑(DDP)和替莫唑胺(TMZ)聯(lián)用，觀察了其對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株化療敏感性的影響。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 10種膠質(zhì)瘤細(xì)胞株T98-G、SF295、U87、UW28、UWR-7、SF767、U251、SKMG-1、SKMG-4、和MGR-2。RPMI-1640培養(yǎng)液(含有10%胎牛血清，100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素)、胎牛血清、胰蛋白酶(Gibcol公司)，MTT、DMSO、VPA溶液(Sigma公司)，細(xì)胞裂解液(Cell Signaling公司)，DDP(山東齊魯制藥廠)，TMZ(天津天士力公司)。超凈工作臺(tái)、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Shel Lab)、倒置顯微鏡(Olympus)、低溫離心機(jī)(Eppendorf)、-80℃冰箱(日本SANYO公司)、酶標(biāo)儀(Model 550 Bio-Rad)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞株培養(yǎng) 復(fù)蘇凍存的膠質(zhì)瘤細(xì)胞株加入適量 RPMI 1640培養(yǎng)液，放入37℃、5%CO2、90%濕度培養(yǎng)箱中，常規(guī)換液、傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，100 μl/孔，每孔(2 ～3)×103個(gè)細(xì)胞。將96 孔板放入37℃、5%CO2、90%濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)到貼壁70%～80%進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.2 藥物分組及處理 取培養(yǎng)的細(xì)胞株分為五組?？瞻讓?duì)照組予普通培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)(含有相同濃度溶媒);DDP組及TMZ組均分別按其血藥峰濃度的值設(shè)置 0.78、1.56、3.12、6.24、12.48、25、50、100 μg/ml 8個(gè)質(zhì)量濃度;VPA聯(lián)合DDP組予1.0 mmol/L VPA處理細(xì)胞72 h后加入上述濃度DDP;VPA聯(lián)合TMZ組予1.0 mmol/L VPA處理細(xì)胞48 h后加入上述濃度的TMZ。

1.2.3 半數(shù)抑制濃度(IC50)及增敏倍數(shù)(ER)檢測(cè) 五組每孔加入5 g/L MTT溶液20 μl，37℃作用4 h，吸去每孔上清，加入100 μl DMSO溶液，振蕩5 min，自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定各孔570 nm波長(zhǎng)處吸光度(OD)值。計(jì)算IC50及ER。ER=IC50(單藥)/IC50(合用藥物)，ER＞1表示非用增強(qiáng)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，各組間的差異采用t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

空白對(duì)照組IC50及ER均為0。VPA與DDP的協(xié)同作用見表1。VPA與TMZ的協(xié)同作用見表2。

表1 DDP組與VPA聯(lián)合DDP組的IC50值與 ER 比較(±s)

表1 DDP組與VPA聯(lián)合DDP組的IC50值與 ER 比較(±s)

注:與DDP組比較，*P＜0.05

細(xì)胞株DDP組 VPA聯(lián)合DDP組 ER值IC50 T98-G 3.07±0.53 2.17±0.33 1.42 SF295 2.73±0.15 1.22±0.19* 2.24 U87 4.62±0.34 4.06±0.65 1.14 UWR-7 21.42±1.32 21.76±3.56 0.98 SKMG-1 7.54±0.58 3.09±0.78* 2.44 SKMG-4 9.59±0.98 9.68±1.89 0.99 MGR-2 2.97±0.42 2.89±0.37 1.02 U251 8.20±1.21 6.01±2.13 1.23 UW28 13.34±4.11 8.81±3.12* 1.51 SF767 5.32±3.12 2.09±1.23*2.55

表2 TMZ組與VPA聯(lián)合TMZ組的IC50值與 ER 比較(±s)

表2 TMZ組與VPA聯(lián)合TMZ組的IC50值與 ER 比較(±s)

注:與TMZ組比較，*P＜0.05

細(xì)胞株TMZ組 VPA聯(lián)合TMZ組 ER值IC50 T98-G 9.41±3.42 9.82±2.58 0.96 SF295 8.23±2.23 8.08±1.98 1.02 U87 5.35±1.91 3.15±1.12* 1.70 UWR-7 11.92±2.32 3.25±0.56* 3.67 SKMG-1 6.83±1.58 5.69±1.78 1.21 SKMG-4 4.34±1.98 3.88±1.09 1.12 MGR-2 8.92±2.42 6.96±0.37 1.28 U251 1.45±0.29 1.09±0.09 1.33 UW28 4.91±1.11 1.48±3.12* 3.31 SF767 4.32±1.12 1.59±0.48*2.72

3 討論

研究證實(shí)，組蛋白乙酰化修飾與腫瘤發(fā)生有關(guān)。組蛋白乙?；兔撘阴；瘏⑴c了真核基因組整體表達(dá)水平的調(diào)控，是一可逆的動(dòng)態(tài)過程，而其穩(wěn)定狀態(tài)的維持則是多種組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶(HATs)和組蛋白脫乙?；?HDAC)共同作用的結(jié)果［2］。HDAC抑制劑主要通過改變組蛋白的乙?；潭葋砀淖?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)，從而調(diào)控基因表達(dá)。VPA作為HDAC抑制劑的一種，可能是通過改變腫瘤細(xì)胞組蛋白乙?；癄顟B(tài)來改變相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。

DDP是治療膠質(zhì)瘤的一線化療藥物之一，由于耐藥性的存在，極大地影響了膠質(zhì)瘤對(duì)其敏感的程度，限制了其臨床療效。膠質(zhì)瘤對(duì)DDP的耐藥機(jī)制復(fù)雜，是多因素綜合作用的結(jié)果。細(xì)胞周期改變可能與DDP耐藥有關(guān)［3］。DDP的細(xì)胞毒作用主要是與核蛋白連接，形成藥物與DNA鏈外、內(nèi)交聯(lián)以及DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)，引起DNA損傷，使細(xì)胞阻滯于G0/G1期不能進(jìn)入S期，導(dǎo)致細(xì)胞死亡［4］。我們前期研究結(jié)果提示，VPA作用于人膠質(zhì)瘤細(xì)胞后，可使細(xì)胞周期發(fā)生變化，呈G1或G2/M期阻滯，提示VPA將細(xì)胞阻滯于DNA合成前期，阻止DNA合成。本研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用VPA處理膠質(zhì)瘤細(xì)胞72 h后，再用DDP，則DDP殺傷力增強(qiáng)。提示VPA可能增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物DDP的敏感性。其機(jī)制可能是應(yīng)用VPA之后，打破了乙?；c脫乙?；g的平衡狀態(tài)。組蛋白高度乙?；谷旧w結(jié)構(gòu)疏松，能夠激活多種轉(zhuǎn)錄因子，抑制DNA復(fù)制;而且處于松弛狀態(tài)染色體，利于DDP進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，與DNA結(jié)合發(fā)揮作用。但是在SKMG-1、U251、UW28、SF767 細(xì)胞，單獨(dú)應(yīng)用 VPA 未達(dá)到有效的抑制作用;聯(lián)合應(yīng)用后亦能促使DDP殺傷膠質(zhì)瘤細(xì)胞的效果增強(qiáng)，此說明單獨(dú)應(yīng)用VPA能夠改變?nèi)旧w的結(jié)構(gòu)狀態(tài)，有利于DDP進(jìn)入細(xì)胞結(jié)合更多的DNA，形成加合物殺傷細(xì)胞。部分膠質(zhì)瘤細(xì)胞聯(lián)合用藥未出現(xiàn)預(yù)期的協(xié)同作用，是否與用藥劑量、用藥時(shí)間有關(guān)系尚不清楚。

TMZ是一種新型的口服二代烷化劑咪唑四嗪類衍生物，其通過對(duì)DNA的強(qiáng)甲基化，導(dǎo)致DNA錯(cuò)配修復(fù)失敗而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)［5］。而DNA甲基化影響人類基因組的轉(zhuǎn)錄抑制、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)修飾、基因組印跡［6］，抑制重復(fù)序列及寄生DNA成分對(duì)基因組完整性的損害［7］。除了DNA甲基化，組蛋白的乙?；揎椧材苡绊?DNA結(jié)構(gòu)變化，影響基因表達(dá)［8］。VPA是HDAC抑制劑，進(jìn)入人體后能促使組蛋白保持高度乙?；谷旧w保持松弛狀態(tài)，在這種情況下應(yīng)用TMZ可使特定部位的DNA斷裂不能進(jìn)行修復(fù)，達(dá)到更有效的抗腫瘤作用。本研究結(jié)果證實(shí)，體外VPA在1.0 mmol/L的濃度時(shí)，能夠增強(qiáng)DDP、TMZ這兩種不同的化療藥物對(duì)大部分膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷作用。證實(shí)VPA可增強(qiáng)DDP和TMZ的殺傷腫瘤作用，但其具體作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

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