劉曉梅，尤紅娟，孫亞峰，關秋華，張光毅，裴冬生

(1徐州醫(yī)學院基礎學院，江蘇徐州221004;2徐州醫(yī)學院腫瘤生物治療重點實驗室)

癲癇發(fā)作可造成選擇性的神經(jīng)元凋亡及死亡。研究證實，細胞凋亡的發(fā)生依賴于死亡受體途徑或線粒體途徑;癲癇發(fā)作可導致線粒體 Bax的積聚［1］。2008年7月～2009年6月，我們觀察了癲癇大鼠海馬CA3區(qū)凋亡相關蛋白表達情況，探討癲癇導致神經(jīng)元凋亡的分子機制。

1材料與方法

1.1 實驗材料 雄性SD大鼠48只，體質量(230±20)g，清潔度Ⅱ級，由徐州醫(yī)學院實驗動物中心提供。將其分為觀察組36只和對照組12只。KA購自Biomol公司;兔抗Bax多克隆抗體購自Cell Signaling公司;兔抗c-Jun、p-c-Jun、FasL、Fas、Bcl-2 多克隆抗體購自Santa Cruz公司;羊抗兔IgG購自Sigma-Aldrich公司;原位凋亡檢測試劑盒購自Chemicon公司。

1.2 癲癇模型建立 觀察組腹腔注射溶于生理鹽水的海人藻酸(KA)12 mg/kg(體積為3.2 ml/kg);對照組腹腔注射等量生理鹽水。注射3 h后觀察組出現(xiàn)3次以上Ⅳ～Ⅴ級癲癇發(fā)作，即制模成功。

1.3 海馬CA3區(qū)凋亡相關蛋白檢測 采用免疫印跡法。KA注射后3、6、12 h及1、3 d各取6只大鼠快速斷頭取腦，分離雙側海馬，取其CA3區(qū)，勻漿，800 g×15 min于4℃離心，移取上清液為胞質部分，置-80℃冰箱待用。上清液移取后沉淀，加入0.5 ml的Buffer A洗1次，4℃、1 000 g×15 min離心，棄上清;再加0.5 ml的Buffer B于4℃搖勻30 min，4℃、12 000 g×15 min離心，小心移取上清液為胞核部分，置-80℃冰箱保存(以上操作均在冰水浴中進行)。采用改良Lowry's法，以牛血清白蛋白(BSA，fractionⅤ)為標準蛋白。等量蛋白樣品SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，以濕轉或半干轉法電轉移至NC膜上，室溫封閉3 h后加入一抗，4℃過夜，取出，洗膜3次，然后加入二抗，室溫2 h，洗膜3次，NBT/BCIP顯色。圖像處理儀(Gene Company)分析 p-c-Jun、FasL、Bax、Bcl-2 的表達(以對照組為基準，用倍比數(shù)表示)。

1.4 海馬CA3區(qū)神經(jīng)元凋亡檢測 制模7 d時，10%水合氯醛(0.36 ml/100 g)麻醉大鼠，以生理鹽水和多聚甲醛行心室灌注［2］，斷頭取腦，用4%多聚甲醛固定12 h左右，梯度乙醇脫水，二甲苯透明(1.5 h)、60℃浸蠟(1 h×3次)。取出包埋，4℃保存。制作切片(厚5 μm)，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，行 TUNEL染色［3］，蘇木素復染，光鏡下觀察凋亡神經(jīng)元細胞(無完整細胞形態(tài)且著色為褐色)情況。以TUNEL法計數(shù)CA3區(qū)1 mm長度范圍內(nèi)凋亡神經(jīng)元個數(shù)，取3個視野的平均數(shù)。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件。計量數(shù)據(jù)以±s表示。組間差異用單因素方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 海馬CA3區(qū)凋亡相關蛋白表達 見表1。

表1 兩組海馬CA3區(qū)凋亡相關蛋白表達(n=6，±s)

表1 兩組海馬CA3區(qū)凋亡相關蛋白表達(n=6，±s)

注:與對照組比較，*P＜0.05;與6 h比較，△P＜0.05

組別p-c-Jun FasL Bax Bcl-2觀察組3 h 2.87±0.12* 1.26±0.20 2.28±0.17* 0.86±0.11 6 h 5.12±0.25* 5.65±0.18* 5.66±0.21* 0.65±0.13 12 h 4.98±0.16* 5.43±0.23* 5.54±0.16* 0.49±0.29*1 d 4.13±0.27* 2.76±0.18＊△5.61±0.14* 0.38±0.15*3 d 1.34±0.13△ 1.15±0.27 5.58±0.12* 0.23±0.10*對照組1.0 1.0 1.0 1.0

2.2 兩組海馬CA3區(qū)凋亡神經(jīng)元的情況 制模7 d海馬CA3區(qū)凋亡細胞，其胞核著色，并見核固縮，凝集，呈不規(guī)則形，出現(xiàn)凋亡小體。觀察組及對照組凋亡細胞數(shù)分別為(177.0±24.7)、(21.4±6.8)個，P ＜0.05。

3 討論

近年來細胞凋亡調節(jié)基因和受體引起臨床關注，但其在癲癇發(fā)作過程中確切的分子機制尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，在KA誘導的癲癇模型中，即早基因C-fos mRNA及其蛋白的表達水平在齒狀回及海馬的CA1、CA3區(qū)顯著升高［6］;腦缺血再灌注引起的神經(jīng)元細胞損傷可通過c-Jun的N-端激酶(JNK)下游的兩條通路即核通路與非核通路介導［7，8］。一方面激活的JNK轉錄到核內(nèi)，磷酸化轉錄因子c-Jun，可增強轉錄因子AP-1復合物活性并進一步促進多種凋亡蛋白表達，如FasL通過與受體Fas的結合，可啟動Fas介導的凋亡信號通路;另一方面部分激活的JNK仍在胞質中，調節(jié)一些非核底物，進而促進細胞色素C的釋放，啟動線粒體介導的細胞凋亡通路。本研究結果顯示，制模7 d大鼠海馬CA3區(qū)可觀察到大量神經(jīng)元凋亡細胞;而在制模6、12 h，海馬CA3區(qū)細胞核內(nèi)c-Jun的磷酸化和表達即有顯著升高，胞質中FasL的表達在制模6 h亦顯著增加，而Fas的表達無明顯變化。表明核通路介導了癲癇導致的神經(jīng)元凋亡。

Bcl-2家族中抑制和促進細胞凋亡的兩類蛋白比例決定細胞在受到外來信號刺激后是否發(fā)生凋亡。Bcl-2/Bax常以二聚體的形式結合在一起，一旦遇到外來刺激，Bax從二聚體釋放，其過表達可拮抗Bcl-2的保護作用而誘導細胞凋亡。本研究觀察組CA3區(qū)胞質中Bax蛋白表達于制模6 h急劇增加，并持續(xù)到第3天;而Bcl-2的蛋白表達卻明顯降低，提示非核通路亦介導了癲癇所致的神經(jīng)元凋亡。

綜上所述，c-Jun介導的核通路和Bcl-2、Bax介導的非核通路共同參與了癲癇所致的海馬神經(jīng)元凋亡;此為進一步研究癲癇發(fā)作誘導神經(jīng)元凋亡的分子機制提供了實驗依據(jù)。

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