宋小妹， 房 方， 蔡 皓， 蔡寶昌*

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇南京 210046;2.陜西中醫(yī)學(xué)院，陜西咸陽(yáng) 712046）

珠子參為五加科植物珠子參（Panax japonicusC.A.Mey.var.major（Burk.）C.Y.Wu et K.M.Feng或羽葉三七Panax japonicusC.A.Mey.var.bipinnati-fidus（Seem）C.Y.Wu et K.M.Feng的干燥根莖。主產(chǎn)于四川、云南、貴州、甘肅、陜西、西藏等。具有補(bǔ)肺、養(yǎng)陰、活絡(luò)、止血之功效，主要用于氣陰兩虛、煩熱口渴、虛勞咳嗽、跌撲損傷、關(guān)節(jié)疼痛、咳血、外傷出血等癥的治療［1］。化學(xué)研究表明，珠子參主要活性成分為多種皂苷類(lèi)［2］。藥理實(shí)驗(yàn)表明皂苷類(lèi)成分具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜［3］、增強(qiáng)免疫力［4，5］、抗腫瘤［6］等活性。從現(xiàn)行各種標(biāo)準(zhǔn)來(lái)看，珠子參飲片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)尚不完善。為此，本實(shí)驗(yàn)在對(duì)珠子參系統(tǒng)研究的基礎(chǔ)上，以珠子參主要皂苷類(lèi)成分人參皂苷Ro、竹節(jié)參皂苷IVa等為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)珠子參飲片進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)研究，以保證其臨床用藥的安全有效。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 珠子參藥材 分別購(gòu)于四川、云南、貴州、湖北等地。經(jīng)陜西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院王繼濤高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定，為珠子參Panax japonicusC.A.Mey.var.major（Burk.）C.Y.Wu et K.M.Feng的干燥根莖。

1.2 珠子參飲片 珠子參飲片為相應(yīng)藥材炮制的加工品（炮制方法:取原藥材，挑出雜質(zhì)，水洗，清水噴淋3次，放置5 h，切厚片。70℃干燥5 h，過(guò)篩，即得）。

1.3 儀器及試劑

1.3.1 儀器 Waters高效液相色譜儀;2996紫外檢測(cè)器，Epower工作站;SB-3200D型超聲清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司，180 W，40 kHz）;BP-121S電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

1.3.2 藥品與試劑 乙腈為色譜純（SK Chemicals公司）;其余試劑均為分析純;水為娃哈哈純凈水;人參皂苷Ro對(duì)照品、竹節(jié)參皂苷Ⅳa對(duì)照品（均為自制，經(jīng)1HNMR、13CNMR、HMBC、HMQC 及 HR-MS確定結(jié)構(gòu);面積歸一法計(jì)算含量均大于98%，符合含量測(cè)定要求）。

2 方法與結(jié)果

2.1 飲片性狀 本品為類(lèi)圓形或不規(guī)則塊片，直徑0.2～1.8 cm。表面棕黃色或黃褐色，有皺紋;切面淡黃白色，粉性;或黃白色或黃棕色，略呈角質(zhì)樣。氣微，味微苦、微甘。

2.2 粉末顯微特征 本品粉末黃白色、灰白色或棕黃色。木栓細(xì)胞表面觀呈多角形，壁薄，非木化;切面觀類(lèi)方形，內(nèi)含紅棕色分泌物。草酸鈣簇晶多，整個(gè)薄壁細(xì)胞組織均有分布，直徑20～76 μm，棱角多寬鈍，少數(shù)較尖。導(dǎo)管多為網(wǎng)紋，直徑20～46 μm，螺紋、梯紋導(dǎo)管可見(jiàn)。

2.3 薄層色譜鑒別 取本品粉末1 g，加甲醇30 mL超聲處理40 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL加熱溶解，水飽和正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL加熱溶解，作為供試品溶液。另取人參皂苷Ro對(duì)照品、竹節(jié)參皂苷Ⅳa對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL各含2.0 mg的對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（附錄Ⅵ B）試驗(yàn)，分別吸取竹節(jié)參皂苷Ⅳa對(duì)照品溶液、人參皂苷Ro對(duì)照品溶液各 2 μL，供試品溶液 2 μL 和/或 5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水（5∶10∶0.5∶0.3∶3.5）上層液為展開(kāi)劑展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，于105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外燈（300 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。見(jiàn)圖1。

2.4 檢查

2.4.1 水分測(cè)定 依照《中國(guó)藥典》2005年版（一部）水分測(cè)定法（附錄IX H第一法）進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定數(shù)據(jù)及結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1 珠子參飲片薄層色譜圖1、8.分別為竹節(jié)參皂苷Ⅳa對(duì)照品、人參皂苷Ro對(duì)照品 2、3.四川樣品溶液（點(diǎn)樣量分別為2 μL、5 μL）4.云南樣品溶液 5.貴州樣品溶液 6、7.湖北樣品溶液（點(diǎn)樣量分別 2 μL、5 μL）Fig.1 TLC chromatogram of prepared pieces of Rhizoma Panacis majoris1、8.Chikusetsusaponin IVa and ginsenoside Ro reference substance 2-7.samples

表1 珠子參飲片中水分、灰分、酸不溶灰分及人參皂苷Ro、竹節(jié)參皂苷Ⅳa含量Tab.1 Determination results of prepared pieces of Rhizoma Panacis majoris

2.4.2 總灰分 依照《中國(guó)藥典》2005年版總灰分測(cè)定法（附錄IX K）進(jìn)行測(cè)定。數(shù)據(jù)及結(jié)果見(jiàn)表1。

2.4.3 酸不溶性灰分測(cè)定 依照《中國(guó)藥典》2005年版一部總灰分及酸不溶性灰分測(cè)定法（附錄IX K）進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定數(shù)據(jù)及結(jié)果見(jiàn)表1。

2.5 含量測(cè)定

2.5.1 色譜條件 色譜柱:Kromasil Column C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）;流動(dòng)相:乙腈-0.2%磷酸溶液（36∶64）;檢測(cè)波長(zhǎng):203 nm;流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣量:20 μL;柱溫:30℃;理論板數(shù)按竹節(jié)參皂苷Ⅳa峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

2.5.2 對(duì)照品溶液制備 分別取竹節(jié)參皂苷Ⅳa對(duì)照品和人參皂苷Ro對(duì)照品適量，精密稱定，加60%乙醇配制成竹節(jié)參皂苷Ⅳa 0.260 5 mg/mL，人參皂苷Ro 0.521 0 mg/mL的溶液，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

2.5.3 供試品溶液配制 取珠子參粉末（過(guò)2號(hào)篩）約0.1 g，精密稱定，加60%乙醇溶液30 mL，超聲處理40 min，取出，加60%乙醇補(bǔ)足重量，濾過(guò)，取續(xù)濾液即得。

2.5.4 線性關(guān)系考察 取上述對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣1、2.5、5、10、15、20 μL，測(cè)定峰面積，分別以人參皂苷Ro和竹節(jié)參皂苷Ⅳa進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回歸方程得:人參皂苷 Ro:Y=1.5×105X－7 909（r=0.999 9），竹節(jié)參皂苷Ⅳa:Y=3.2×105X－18 460（r=1）。結(jié)果表明，人參皂苷Ro在0.51～10.26 μg范圍內(nèi)、竹節(jié)參皂苷Ⅳa在0.26～5.21 μg范圍內(nèi)，峰面積Y與進(jìn)樣量（μg）X線性關(guān)系良好。

2.5.5 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液10 μL，照2.5.1項(xiàng)下色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定人參皂苷Ro和竹節(jié)參皂苷Ⅳa峰面積。結(jié)果表明，本法精密度良好，人參皂苷Ro峰面積RSD為0.68%，竹節(jié)參皂苷Ⅳa峰面積RSD為1.07%。

2.5.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液分別于0、2、4、8、12、18、24 h 內(nèi)進(jìn)樣，照 2.5.1 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定人參皂苷Ro和竹節(jié)參皂苷Ⅳa峰面積。結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)峰面積穩(wěn)定，人參皂苷Ro峰面積RSD為0.68%，竹節(jié)參皂苷Ⅳa峰面積RSD為1.61%。

2.5.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品，平行稱取6份，按2.5.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照2.5.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定人參皂苷Ro和竹節(jié)參皂苷Ⅳa含量。結(jié)果表明，本法具有較好的重復(fù)性，人參皂苷Ro和竹節(jié)參皂苷Ⅳa RSD分別為1.84%和1.93%。2.5.8 回收率試驗(yàn) 取已知含量的樣品5份，各0.1 g，精密稱定，精密加入人參皂苷Ro和竹節(jié)參皂苷Ⅳa對(duì)照品適量，按2.5.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.5.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定人參皂苷Ro和竹節(jié)參皂苷Ⅳa含量。計(jì)算回收率，見(jiàn)表2、表3。結(jié)果表明，本法回收率良好，人參皂苷Ro和竹節(jié)參皂苷Ⅳa的RSD分別為0.46%和0.91%。

表2 人參皂苷Ro回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of recovery test of ginsenoside Ro

表3 竹節(jié)參皂苷Ⅳa回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of recovery test of chikusetsusaponin IVa

2.5.9 樣品含量測(cè)定 取不同批次樣品粉末約0.1 g（各2份），精密稱定，按2.5.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣20 μL，按2.5.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜峰面積，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表1。對(duì)照品和供試品HPLC圖譜見(jiàn)圖2。

圖2 珠子參飲片HPLC圖譜A.對(duì)照品 B.四川珠子參樣品 C.湖北珠子參樣品 1.人參皂苷Ro 2.竹節(jié)參皂苷ⅣaFig.2 HPLC chromatograms of prepared pieces of Rhizoma Pannacis majorisA.reference substances B.sample of sichuan C.sample of Hubei 1.ginsenoside Ro 2.chikusetsusaponin IVa

3 討論

3.1 實(shí)驗(yàn)過(guò)程所用人參皂苷Ro對(duì)照品和竹節(jié)參皂苷Ⅳa對(duì)照品均為自制，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1HNMR、13CNMR、HMBC、HMQC及HR-MS等方法予以鑒定確認(rèn);純度檢查采用HPLC法，面積歸一法計(jì)算含量，純度均在98%以上，分別達(dá)到了含量測(cè)定所用對(duì)照品的技術(shù)要求。

3.2 薄層色譜鑒別用于中藥鑒別具有快速簡(jiǎn)便等特點(diǎn)。珠子參飲片的薄層色譜鑒別條件的確定，是在對(duì)實(shí)驗(yàn)條件的系統(tǒng)考查基礎(chǔ)上確立的，而且經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)證明，該方法具有分離度好、斑點(diǎn)清晰、簡(jiǎn)便易行等特點(diǎn)，可用于珠子參飲片的鑒別。

3.3 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)供試品溶液制備的提取方法、提取溶媒、提取時(shí)間等條件進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)考察。結(jié)果表明，該實(shí)驗(yàn)條件提取率高、雜質(zhì)少、操作簡(jiǎn)便，可用于珠子參飲片的提取。

3.4 本試驗(yàn)首次建立了HPLC法同時(shí)測(cè)定珠子參飲片中人參皂苷Ro、竹節(jié)參皂苷Ⅳa含量的方法。該方法專(zhuān)屬性強(qiáng)、靈敏度高、重現(xiàn)性好，可用于評(píng)價(jià)珠子參飲片的質(zhì)量。

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